雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和no分泌的影响论文

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1、雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影响论文【摘要】目的：观察雷帕霉素对大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPC）增殖、凋亡及一氧化氮（NO）分泌的影响.方法：密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPCs，无菌条件下培养6d；实验分为5组：对照组及不同浓度（0.1,1.0,10,100μg/L）雷帕霉素组.各组皆于24h后收集标本，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，硝酸还原酶法检测培养液中的NO含量.结果：与对照组相比，1.0~100μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌

2、，并诱导EPCs凋亡（P0.05），具有浓度依赖性.结论：1.0~100μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌.freelRNA的表达［3-5］.作者拟观察雷帕霉素对EPC增殖、凋亡及NO分泌能力的影响，旨在为药物洗脱支架的内皮化延迟提供实验依据.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠，体质量（100±5）g，由第四军医大学实验动物中心提供.试剂和材料：Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程医学研究所，胎牛血清为Hyclone产品；M199为Gibco产品，血管内皮生长因子（V

3、EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）为美国CYTOLAB产品，雷帕霉素购自福建科瑞药业有限公司，NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所，DiIacLDL为美国invitrogen公司产品，FITCUEAI为美国Sigma产品；ApoAlertTMAnnexinV凋亡检测试剂盒为美国Clontech公司产品.仪器有：荧光显微镜（Leica），倒置相差显微镜（Olympus），离心机（Sorvall），酶联免疫检测仪（美国BioRAD公司），EliteESP型流式细胞仪（美国COULT

4、ER公司），UV22450分光光度计（日本SHIMADZU公司）.1.2方法1.2.1大鼠骨髓EPC的分离颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取出四肢长骨，750mL/L酒精内浸泡5min，用含肝素的培养液冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，以1∶2的比例叠加到Ficoll淋巴细胞分离液上，保持液面清晰，离心（2000r/min）20min，小心吸取中间云雾状单核细胞层，5倍体积M199重悬，离心（1500r/min）10min，洗涤两次后弃上清，用含胎牛血清（100mL/L），VEGF（10μg/L）及bFGF

5、（10μg/L）的M199重悬细胞，调整浓度为4×108/L，接种于培养瓶中，取4h未贴壁的细胞，在37℃，50mL/LCO2条件下培养.1.2.2EPC的表型鉴定将培养6d的细胞与DiIacLDL(2.4μg/mL)37℃下孵育1h，然后用40g/L多聚甲醛固定10min.PBS液浸洗后将FITCUEAI(10μg/mL)加于上述标本，37℃下孵育1h.用荧光显微镜进行鉴定，DiIacLDL和FITCUEAI染色双阳性细胞为正在分化的EPCs.1.2.3实验分组细胞培养6d后，用

6、2.5g/L胰蛋白酶、0.2g/L乙二胺四乙酸消化，全培养液重悬呈单细胞悬液后，分别接种于96孔培养板（以1.5×104细胞/孔的密度）及培养瓶（以5×105细胞/瓶的密度）.实验分为5组：对照组（仅加入全培养液）及不同浓度雷帕霉素（0.1，1.0，10，100μg/L）组.各组皆于24h后收集标本.1.2.4MTT比色法检测细胞增殖96孔培养板收集的各组标本，每孔加浓度为5g/L的MTT溶液20μL，在37℃，50mL/LCO2孵箱中继续孵育4h；终止培养，吸弃上清液，每孔加入150μL的DMS

7、O，振荡10min，在酶联免疫检测仪上490nm波长处测定各孔吸光度（A490），用只加培养液不加细胞的空白孔调零.1.2.5流式细胞仪双标法检测细胞凋亡率各组细胞用0.01mol/LPBS冲洗，1.25g/L胰蛋白酶消化收集细胞；离心去除固定液，用含血清培养液洗1遍，用ApoAlertTMAnnexinV凋亡检测试剂盒染色，5×105细胞用1×Bindingbuffer漂洗1次；细胞重悬于200μL1×Bindingbuffer.加入AnnexinV5μL和碘化丙啶（PI）10μL，室温避光10

8、～20min，上机（流式细胞仪）测试.AnnexinV+/PI-细胞数量代表凋亡细胞数量.1.2.6NO水平测定采用硝酸还原酶法.每孔吸取上清100μL，按试剂盒说明书检测各孔上清NO水平.统计学处理:实验重复8次，数据以x±s表示.应用SPSS10.0进行统计分析，采用单因素方差分析（One,etal.Roleoftheendotheliuminmodulatingneointimalformation:vasculoprotectiveapproachestoattenuat