斑马鱼几种cyp基因在性腺不同发育阶段表达研究

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1、斑马鱼几种CYP基因在性腺不同发育阶段表达研究1绪论1.1细胞色素P450研究进展细胞色素P450（CYP450）蛋白酶超家族是一类血红蛋白酶，与其他血红蛋白酶类相同其也以血红素为辅基。其之所以命名为细胞色素P450，是因为还原型细胞色素P450易与一氧化碳结合，且能生成一复合物，这种复合物在450nm处有一吸收峰。细胞色素P450酶系中的酶类主要在内质网、微粒体、线粒体等于物质代谢相关的细胞器膜和质膜分布，其主要以膜结合和可溶性两种形态存在[1]。细胞色素P450酶系的催化作用得以实现，依赖于电子供体NADPH，细胞色素P450酶具有通过2个辅基FAD和FMN从NAD

2、PH转移电子的能力[2]。细胞色素P450酶系所催化的反应可简单表示如下：NADPH+H++O2+RH=NADP++H2O+ROH，其中，R表示底物，如甾体、脂肪酸或带有烯烃、烷烃、芳香环或杂环取代基的化合物，常作为氧化作用的位点[3]。生物体内生物活性小分子的生成、外援物质如药物代谢等都离不开这一反应，因此对于生物体而言该反应具有非常重要的作用。已有研究证明，这一反应为细胞色素P450酶系在体内发挥诸多功能例如烷基的羟化，烯基的环氧化，烃基的氧化等[4]的基础反应。细胞色素P450酶系参与多种反应，其作用底物多种且催化反应种类也多种，这一特点使其成为是很多内源性和外源

3、性物质代谢反应过程中的关键酶系[5]。..1.2斑马鱼细胞色素P450研究进展细胞色素P450超基因家族是一类编码参与一些内源性物质(如激素、胆固醇)和外源性物质（如药物、环境化合物）代谢的酶系的超基因家族[33]。细胞色素P450基因家族是一个成员数目巨大的庞大的家族，该基因超家族约有100个家族，包括600多个成员，广泛存在与动物、植物、微生物的各种组织中。为了好区分数目庞大的细胞色素P450基因以及方便对其进行研究，细胞色素P450基因家族被分为多个家族、亚家族，其分类的主要依据为细胞色素P450基因家编码的蛋白质的氨基序列之间的同源性。氨基酸序列的同源性达到40

4、%以上即可归类为一个家族，氨基酸序列的同源性达到55%以上即可归类为一个亚家族[34]。细胞色素P450基因的表示，以英文字母CYP代表，家族以CYP后的阿拉伯数字代表，而亚家族以阿拉伯数字后的大写字母表示，例如CYP1A等。斑马鱼中共存在94种CYP基因，分布于18个基因家族，而且这些基因家族同样存在于人类和哺乳动物，与人类CYP基因相同，斑马鱼CYP基因按其功能可分为两类：一类是与内分泌相关的基因CYP5-CYP51，另一类为外援物质代谢相关基因,CYP1-CYP3，以及稍相关的CYP4家族[35]。2材料与方法2.1实验材料（1）焦碳酸二乙酯(DEPC)，EDTA

5、-Na2，IPTG，X-gal，氨苄青霉素，蛋白酶K，琼脂糖，Tris，蛋白胨，酵母粉，琼脂粉购自大连盈欣化学试剂有限公司；（2）异丙醇，氯仿，乙酸钠，无水乙醇，氢氧化钠，冰乙酸，氯化锰，氯化钙，氯化钠，氯化钾，盐酸,SDS，苦味酸，冰乙酸，甲醛，盐酸，二甲苯，石蜡，甘油，苏木精，伊红，中性树胶等购自大连沈联化学试剂玻璃仪器有限公司。（3）TRizol试剂，pUCM-T载体，DL-2000DNAMarker，SYBRPremixExTaqTMⅡKit(TliRNaseHPlus)均购自TakaRa（大连）公司，DH5α感受态由本实验室保存；（4）TaqDNA

6、聚合酶,PCR回收试剂盒,质粒提取试剂盒,6Loadingbuffer,实验所用引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；（5）M-MLV反转录酶购自天根生化科技（北京）有限公司。.2.2实验方法本实验室，水族箱规格50cm35cm35cm。水族箱及其内部过滤设备等刚买回需用3%高锰酸钾进行浸泡，然后用清水洗净。缸中用水草专用底泥种植水草，水草养殖半月左右，待缸内稳定方可将斑马鱼放入。此外，缸内水为经过曝气的自来水，水流自动循环，水中充氧，缸中置的加热棒，加热棒数目随室温增减，水温控制在25℃左右。亲鱼每天投喂商品饵料（脱壳丰年虾卵），每天投喂3次，投喂时采用少量多次

7、方法投喂，繁殖期间可以适当增加投喂量和投喂次数。亲鱼培育期间，保持水质良好，通过上部过滤器来保持水质的相对稳定。每周换水，换入的水为曝气48小时的自来水。斑马鱼在繁殖受光照周期影响，一般在早上日出后产卵。为促进斑马鱼的成熟，繁殖前注意水族箱上水草灯的开关时间。繁殖期间，可适当增加投喂次数，并且增加鲜活饵料的投喂。繁殖前一晚，按照雌雄3：2的比例选择健康亲鱼，放在孵化器内，用遮光布将水族箱罩住，严格控制卡控制光周期为14：10(光照14h，黑暗10h)。第二天早上，给予斑马鱼光照，将孵化器雌雄鱼之间的隔板打开，雌雄斑马鱼追尾交配，其一般在给