腺病毒介导egfp基因转染神经干细胞的实验研究

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1、腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究【摘要】目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS，在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况，同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16h后NSCS发出绿色荧光，在第7天左右荧光强度达高峰并可持

2、续稳定表达20天左右，Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光，部分细胞β-Ⅲtubulin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P>0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS，且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。【关键词】神经干细胞腺病毒增强型绿色荧光蛋白转染基因表达Abstract:ObjectiveToobservetheex

3、pressionofenhancedgreenfluorescentprotein（EGFP）inneuralstemcells（NSCS）ediatedenhancedGFPgene（Ad/EGFP）andthechangesinthebiologicalcharactersofNSCSinrelationtothetransfection.MethodsNSCSfromthehippocampusofneonateraticroscopeandfluorescentmicroscope.Thev

4、itality,multiplicationanddifferentiationofthecellsinedbyusingtrypanbluestainingetc.,andtheresultsissionofgreenfluorescenceinneurospheresstarted16hoursafterthetransfection,intensifiedgradually,reacheditspeakonday7andmaintainedthathighlevelformorethan20d

5、ays.ThegreenfluorescenceultiplicationanddifferentiationbetethodforgeiclabelingofNSCS.Keycells;adenovirusvector;enhancedgreenfluorescentprotein;transfection;geneexpression神经干细胞（NSCS）是指一类具有多分化潜能（能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞），能自我更新和克隆性增殖的一群细胞［1］。在NSCS移植研究中，有必要对

6、NSCS进行示踪标记，以便实时跟踪和区分植入的NSCS和宿主细胞。绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告基因，其表达产物GFP可在紫外光或蓝色光激发下稳定地发出绿色荧光，不需要任何底物或辅助因子。在GFP的基础上进行F64L和S65T突变后的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进一步增强了GFP的荧光性能，使结果更容易观察检测［2］。本实验从新生SD大鼠海马组织中分离神经干细胞，并通过观察携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS后EGFP表达

7、规律及转染对NSCS的活力、增殖、分化等的影响，探讨EGFP作为NSCS的示踪标志物的可行性，为进一步的NSCS移植研究提供体外研究基础。1材料和方法1.1动物24h之内的新生SD大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。1.2主要试剂和仪器DMEM/F12、B27、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、EGF（表皮生长因子）均购自Gibco公司。抗体为:Nestin兔抗鼠多克隆抗体（博士德公司），GFAP单克隆抗体（Sigma公司），β-Ⅲtubulin单克隆抗体（Sigma公司），生物素标记山羊抗小鼠I

8、gG（北京中杉生物试剂公司），山羊抗兔Cy3-IgG（博士德公司），DAB（北京中杉生物试剂公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司）。仪器：CO2培养箱（Thermo，美国），荧光倒置相差显微镜（OlympusIX70，日本）。病毒载体：Ad/EGFP，滴度为2×1011pfu/L。1.3方法1.3.1NSCS的分离、培养及鉴定取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，剥离脑膜血管，将海马组织移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培养液中，尽量将组