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1、小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定论文田蓉，李巍，于继云，刘玉峰【关键词】树突细胞Invitrocultureandcharacterizationofmousespleendendriticcells【Abstract】AIM:Toexploreandoptimizethemethodsforinvitrocultureofmousedendriticcells(DC)thatorphologicallyandidentifiedbiologically.METHODS:Miceg/kgcyclophosphamidethroug
2、hthetailvein,andethodsfirstly,and3dlaterconditionalmediumcontainingIL4,GMCSFicroscope,scanningelectronmicroscope,andtransmissionelectronmicroscopeanalysis.Atday3,5,7,cellsarkers.RESULTS:CulturedcellsdisplayedatypicalDCphenotypeinmorphologicalanalysis,andFACSshoarkers
3、asCD11c,CD86,.freelulatorsinthemousespleencellculturecanobtainDCakesafoundationforfutureresearchonthebasicandclinicalusageofDC.【Keyolecule【摘要】目的：探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定.方法：应用环磷酰胺200mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4,GMCSF细胞因子的条件培养液.freel
4、an等于1973年发现树突状细胞（dentriticcell,DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注.特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域.DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%.目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展.我们在体外培
5、养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加IL4,GMCSF,TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.1材料和方法1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体：CD11cFITC,IAbFITC,H2DbFITC,CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF,rmIL4,TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司
6、生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8g/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8d后颈椎脱位处死小鼠，750mL/L乙醇浸泡10min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800r/min,7min，加TrisNH4Cl3mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109/L细胞，37℃，50mL/LCO2孵箱培养.3d后，
7、吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第5d补加细胞因子TNFγ1mg/L，第7d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC.相差显微镜下观察细胞形态特点.1.2.2扫描电镜观察取如上培养7d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37℃，50mL/LCO2孵箱培养.待细胞汇合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞表面；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的40mL/L戊二醛，在4℃固定2h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃预冷的10g/L锇酸固定，
8、在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构.1.2.3透射电镜观察取如上培养7d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀
