环境微生物学综合实验

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1、实验一光学显微镜的使用，微生物染色和计数技术 Ⅰ、显微镜的使用 一、实验原理微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜(16mm，10´)高倍物镜(4mm，40-45´)和油镜(1.8mm，95-100´)三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照

2、明度就减低了(图Ⅰ-1)。利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：式中数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。式中l=光波波长由上述可知若n值和α角越大则N·A越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大(图Ⅰ-2)。一些物质的折射率：水1.33玻璃1.52空气1.0香柏油1.515。二、实验器材1、 仪器显微镜；2、 材料巨大芽孢杆菌(Bacillusmegater

3、ium)标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。三、操作步骤1、取镜显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图Ⅰ-32、调节光源1)将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5厘米左右。2)上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。图Ⅰ-3光学显微镜的构造1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗

4、调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋3)左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜)。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。一般染色标本油镜检查对，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。3、低倍镜观察低倍物镜(8´或10´)视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：1)先将标本玻片置于载物台上(注意标本

5、朝上)，并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约0.5厘米处。2)左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。3)移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。4、高倍镜观察将高倍物镜(40´)转至镜筒下方(在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野

6、中央，待油镜观察。5、油镜观察1)用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。2)左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。3)如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。4)观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜

7、头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。5)将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。四、注意事项1、显微镜镜头的保护和保养2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线Ⅰ、微生物的染色  一、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的