抗人干扰素α2b单克隆抗体制备及初步鉴定

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1、抗人干扰素α2b单克隆抗体制备及初步鉴定【摘要】本研究以重组人干扰素α2b蛋白免疫巴比西小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得3株可稳定分泌抗人干扰素α2b单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1E8、1E10和4E4。ELISA鉴定结果表明，3株单抗的亚型均为IgG1，腹水效价都在10-6以上。免疫印迹鉴定结果证实，3株单抗均可与原核表达的人干扰素α2b发生特异性反应。结果表明，本研究成功获得3株针对人干扰素α2b的特异性杂交瘤细胞株。【关键词】重组人干扰素α2b；单抗干扰素分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN[1]。干扰素α2b属于Ⅰ型干扰素[2]，它具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高

2、免疫功能等作用。干扰素与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内繁殖，提高免疫功能包括增强巨噬细胞的吞噬功能，增强淋巴细胞对靶细胞的细胞毒性和天然杀伤性细胞的功能[3]。本研究采用重组人干扰素α2b为免疫蛋白，制备抗人干扰素α2b单抗并对其生物学特性进行鉴定，为深入研究人干扰素α2b检测试剂盒提供物质材料。1材料6重组人干扰素α2b：哈药生物提供；胎牛血清，1640培养基，HT，HAT，聚乙二醇：Sigma公司；鼠源单抗亚类试剂盒：SouthernBiotech；其余生化试剂均为分析纯。2方法2.1动物免疫按照萨姆布鲁克J等[4]报道的方法，将重组人干扰素α2b

3、作为免疫蛋白。以1μg/μL的浓度，对6只7周龄巴比西小鼠进行免疫，每只接种100μL，间隔2周免疫一次，共3次，细胞融合于最后一次免疫后7天进行。2.2ELISA方法的建立以重组人干扰素α2b蛋白为抗原包被ELISA板，用碳酸盐缓冲液稀释抗原，方阵法确定蛋白最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释倍数，经HRP标记的山羊抗鼠IgG作用，邻苯二胺底物显色，判定结果。判定标准为阳性血清孔的OD492值接近1.0，阴性血清OD492值＜0.2，P/N≥2.1。2.3细胞融合及筛选抗血清效价检测于第3次免疫后7天进行。取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按常规方法进行融合，HAT筛选融合细胞，采

4、用有限稀释法对阳性克隆进行筛选，达到100%阳性者扩大培养，建株保存。2.4单抗亚类鉴定6按SouthernBiotech公司亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。2.5腹水制备采用体内诱生腹水法，按常规方法制备腹水。用建立的ELISA检测方法测定单抗腹水效价，以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。2.6抗体识别特异性鉴定用三株杂交瘤细胞腹水纯化后蛋白做免疫印迹，结果证实本试验所获得的单抗均能与重组人干扰素α2b反应，说明筛选得到的单抗可以特异性识别人干扰素α2b，进一步证实了所获得单抗的特异性。2.7杂交瘤细胞稳定性分析对已获得的3株杂交瘤细胞进行30次传代，以免疫鼠血

5、清为阳性对照，以空白鼠血清为阴性对照，收集细胞培养上清液并测其效价。3结果3.1间接ELISA方法结果将重组人干扰素α2b原液，分别以8g/ml，4g/ml，2g/ml和1g/ml的浓度包被ELISA板，阳性和阴性血清稀释倍数为1:100、1:500、1:1000，结果显示，抗原浓度在4μg/ml，血清稀释倍数为1/1000时，P/N≥2.1。3.2杂交瘤细胞的融合率6本试验经过3次细胞融合，细胞的融合率达到了87.65%，阳性孔率为0.3%。3.3细胞株的建立细胞融合后，判定为阳性的杂交瘤细胞经3次克隆筛选，获得3株能

6、够稳定分泌抗人干扰素α2b单抗细胞株，分别命名为1E8、1E10和4E4。3.4单抗亚类鉴定经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测，所获3株杂交瘤细胞，均为IgG1型，且都是K轻链抗体。3.5单抗腹水效价测定经鉴定表明3株单抗1E8、1E10和4E4腹水的间接ELSIA效价都在10-6。3.6单抗特异性鉴定（图1）经SDS-PAGE电泳后，将转移至硝酸纤维素膜的蛋白进行单抗孵育。结果显示3株单抗均能特异性的识别人干扰素α2b。123图1免疫印迹分析1：2：3：人干扰素α2b的纯化蛋白3.7细胞分泌抗体稳定性分析结果由图2可知，杂交瘤细胞株经30次传代，能持续并稳定分泌抗体。6图2细胞株稳定性

7、分析4讨论本研究以重组人干扰素α2b为免疫原，免疫巴比西小鼠，获得三株抗人干扰素α2b单抗，分别命名为1E8、1E10和4E4。经鉴定，三株单抗亚类均为IgG1，轻链为K链；杂交瘤细胞连续传代30次，其分泌抗体的能力较稳定；腹水效价均达到10-6以上；免疫印迹实验表明,三株单抗均能够特异性识别人干扰素α2b。目前用于病毒性疾病及肿瘤治疗的干扰素主要有干扰素αlb，干扰素α2a及干扰素α2b亚型，干扰素α2b因其副作用小，疗效高，而更为广泛应用[5]。因此干