dna的琼脂糖凝胶电泳

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1、DNA的琼脂糖凝胶电泳自1937年瑞典的Tiselius创造纸电泳以来，人们又创造了许多新的支持电泳的介质，其中较为常见的是琼脂糖及聚丙烯酰胺。普通琼脂糖凝胶制胶容易，能分离的核酸片段长度范围广（0.2-50kb）,可以区分相差约100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率（5bp）要高于琼脂糖，但它能分离的核酸分子通常<1kb，且制胶等的操作远比制备琼脂糖凝胶来得麻烦。当DNA分子相当大，其双螺旋的半径超出凝胶的孔径时，如果还用普通琼脂糖凝胶电泳进行分离，则DNA可能跑不出胶孔。在这种情况下，应选用脉冲凝胶电泳。脉冲凝胶电泳可以区分相差几百kb的DNA片段。在本节中，我们主要介绍DNA

2、的琼脂糖凝胶电泳。用于分离RNA的琼脂糖凝胶电泳，在胶的制备及所使用的缓冲液等方面与DNA有所不同，请参见相关的章节。琼脂糖是从海藻中提取的线状多聚物。加热到90ºC左右，琼脂糖即可熔化形成清亮透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40-45ºC。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离DNA混合物的目的。DNA分子在碱性条件下（pH8.0-8.3），碱基几乎不解离，而链上的磷酸基团解离，所以整个DNA分子带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子本身的大小和构型，DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同的核酸分

3、子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在碱性条件下，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。电泳装置琼脂糖凝胶电泳现大多使用水平电泳槽。较之早先的垂直电泳槽，水平电泳槽在凝胶的制备上比较灵活，且可使用低浓度的凝胶。由于水平电泳槽的两极是相通的，这样正负极的缓冲液也不会因为电泳时间久了而产生太大的差异。电泳缓冲液在电泳的过程中，H2O被解离，在阳极产生H+,而在阴极产生OH-，即阴极逐渐变碱而阳极逐渐变酸。因此，当带电荷的分子通过支持物介质时，需要使用缓冲液以维持电泳所需的pH值。核酸电泳最常采用的缓冲液有TAE（Tris，AceticacidandEDTA）、TBE(Tris,B

4、oricacidandEDTA)两种。由于这些缓冲液的pH是碱性的，这就使得整条DNA链上的磷酸骨架的净电荷为负，从而在电泳时能向正极泳动。TAE是最常用的电泳缓冲液。但TAE的缓冲能力弱，在长时间的电泳中缓冲能力逐渐丧失，因此长时间电泳时需循环或更换缓冲液。而TBE的缓冲能力较强，长时间电泳时不需要更换或循环。这两种缓冲液的配法如下：TAE（50×母液）TBE（5×母液）242.0gTris碱54.0Tris碱57.1ml冰醋酸27.5g硼酸18.61gNa2EDTA·2H2O3.72gNa2EDTA·2H2O用蒸馏水定容至1升用蒸馏水定容至1升当DNA短于12kb且不需要回收时，用1×TA

5、E或TBE（0.5×或1×）进行电泳均可。如果片段较大，则最好使用TAE为缓冲液，同时将电压调低（1-2V/cm）。这样可减少DNA形成弥散带的机率。TBE则适用于分离<1kb的小片段。电泳时，不论使用哪种缓冲液，只要液面高出水平胶面3-5mm即可。缓冲液太少，则可能使胶在电泳的过程中变干；太多，则会减弱DNA移动的速度，使带变形，还会产生大量的热。选择合适的凝胶浓度不同浓度的琼脂糖凝胶形成的分子筛孔径大小不同。因此需要根据分离的需要，选择适当浓度的凝胶（表1）表1分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度（摘自：李德葆等，1994）琼脂糖浓度（%，W/V）分离DNA片段的有效范围（kb）0.

6、51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-3琼脂糖凝胶中DNA的检测核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）。用EB染色可以检测到1-5ng双链DNA/带。此外也可用SYBRGreenI或II染色。这两种染色剂的灵敏度较EB高，SYBRGreenI及II分别为60pg双链DNA/带及5ng双链DNA/带。EB亦可用于检测单链DNA，只是与单链DNA的结合能力稍为弱些。EB可以嵌入碱基之间，从而增加荧光强度。EB与DNA的复合物可以用紫外线检测。不同波长的紫外线能为DNA或EB吸收，被吸收的能量再转化为波长590nm的可见光的发射

7、出来。通常用水将EB配制成10mg/ml的贮存液。EB见光分解，所以应在避光条件下保存。可以保存在棕色的或外头包裹有铝铂的小瓶中。要获得较好的观察效果，最好是在电泳结束后用EB对琼脂糖凝胶进行染色。其方法是在电泳结束后，将胶（制备胶时不加EB）取出，浸泡在浓度为0.5μg/ml的EB溶液中（此溶液可用蒸馏水，也可用电泳缓冲液配制），于室温下染色20min。EB溶液需要没过胶平面。另一种方法是在配制