snt 1151.5-2003 对虾杆状病毒（bp）检测方法

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1、SI中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1151.5-2003对虾杆状病毒(BP)检测方法ProtocolofdetectionforBaculoviruspenaei2003-05-28发布2003-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1151.5-2003前言本标准是采用OIE的《水生动物健康手册》2000年版的检疫规程。本标准的附录A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、陈莉莉、潘坤永

2、、史秀杰。SN/T1151.5-2003对虾杆状病毒(,BP)检测方法范围本标准规定了用直接显微镜镜检和用聚合酶链式反应(PCR)技术检测对虾杆状病毒的方法。本标准适用于对虾杆状病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实

3、验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)GB/T18088-200。出人境动物检疫采样SN/T1151.3-2002斑节对虾杆状病毒(MBV)诊断方法3试荆和材料段1阳性病毒DNA:由OIE参考实验室提供或由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。乳2水:应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。3.3Taq酶:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4dNTP:含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmol/L,3.5引物:有二对引物可选用。使用时浓度为40Ismol/L。其序列如下:

4、BPIF:5'-GAT-CTGCAA-GAGGAC-AAA-CC-3'BPlR:5'-ATC-GCT-AAGCTC-TGGCAT-CC-3’扩增目的基因中的560饰片段。BP2F:5'-TGT-TCT-CAG-CCA-ATA-CAT-CG3'BP2R:5'-ATC-CTGTTT-CCA-AGC-TCT-GC-3’扩增目的基因中的580by片段。3.6异丙醇:分析纯，使用前预冷到一20-C.37矿物油:要求无DNA酶和RNA酶。3.8DNA分子量标准(Marker),39样品缓冲液:按使用说明书中规定的比例与样品混合。4器材和

5、设备4.1PCR扩增仪。4.2电泳仪。4.3微量移液器及吸头。4.4紫外观察灯。4.5恒温培养箱。4.6普通冰箱和低温冰箱。4.7电动匀浆器。4.8普通显微境。4.9离心机和离心管。4.10剪刀、镊子。SN/T1151.5-20035直接光学显徽镜检查5.1原理取活的(鲜活的、濒死的或有损伤的)对虾的肝胰腺，或者用收集到的粪便样品做湿压片，观察BP在肝胰腺中形成的有特征性的三角形包涵体.52新鲜组织湿片法必须是活虾，取出肝胰腺。幼体在解剖镜下将肝胰腺摘出，置于载玻片上，小心地制备压片。用相差或亮视野显微镜检查，在肝胰腺或中肠

6、的湿压片中，如果观察到上皮细胞的核内有单个或多个四面体的包涵体，就可以诊断为BP感染。包涵体呈四面体或金字塔形，从金字塔底部到顶部的尺寸为0.1lim^20um之间，大多数垂直的长度为8Km-10ftm。可与MBV的球形包涵体明显区分开来。可以按照SN/T1151.3-2002中的方法做组织切片后进行光镜镜检包涵体。5.3粪便检查粪便检查可在不杀死对虾的情况下检查对虾是否带有BP。该方法适用于稚虾或大一些的对虾，在用非致死方法检查有经济价值的亲虾时特别适用。把对虾放在水簇箱、产卵箱或其他合适的水箱中待数小时，直到水箱底部出现

7、粪便。用塑料虹吸管吸取排泄物，放在玻璃离心管中。把粪便制成湿片，直接用显微镜检查包涵体。BP的包涵体是明显的带折射的四面体，高度在0.1fam-20pm之间。聚合酶链式反应(PCR)61样品用收集到的粪便样品、取活的对虾肝胰腺或保存在95环的乙醇中的对虾肝胰腺样品都可以用作PCR检测的模板。6.2DNA抽提在粪便或肝胰腺样品中加人消化缓冲液(见附录A)，样品和缓冲液的比例为1:10.碾碎后，用木质牙签或微量吸管头把样品分散开来。样品在缓冲液里被分散后，60℃加热1h，然后95℃处理10min.12000g离心2min，把上清

8、液移到一个新的微量管中，然后置于冰上保存。移取800pL消化后的样品，在含有样品的离心管中加人600[,L抽提液1(见附录A)，充分混匀30s,12000r/min离心5min，取上层水相(约700I}L)。再加人650}LL抽提液2(见附录A)，充分混匀30s,12000r/min离心5