用mtt比色法建立b型cpg odn活性检测标准

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1、用MTT比色法建立B型CpGODN活性检测标准：王学菊,刘璟,万敏,王莉,吴秀丽,卫红飞,于永利,王丽颖【摘要】　　目的:B型CpGODN,BC和小鼠脾细胞增生的特点,选择无放射性污染的MTT比色法作为首选检测方案。用BTT检测过程以提高反应灵敏度。结果:用3mg/LBI1640培养的6×105个小鼠脾细胞在37℃含50mL/LCO2孵箱中共孵育36h。随后每孔弃100μL上清,加入MTT(5g/L)10μL,37℃避光孵育4h使各孔充分形成甲瓒颗粒。每孔加入DMSO150μL,经平板振荡器振荡20min至颗粒

2、完全溶解,在酶标仪上检测A578值即可。结论:建立了无污染、造价低、可操作性强的BTT比色法脾细胞增生B:BCormicesplenocytes,MTTassayaleBALB/cmiceulatedbyBTTconditionsinedinthesecourses.RESULTS:theentschemeg/LBI1640(entedL/LFBSina96ediumidifiedincubatorL/LCO2,100microlitersupernatantsicroliterMTT(5g/L)ationof

3、formazan.AftericroliterDMSOinutesuntiltheformazanizedMTTassay,ination,lopleoperation,couldbeusedasactivityidentificationofBSO购自天津市光复精细化工研究所。TS1型脱色摇床由江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。CO2培养箱为德国Heraeus公司产品。扫描仪为清华紫光公司产品。MultiskanAscent型酶标仪由芬兰ThermoLabsystems公司生产。　　1.2方法　　1.2.1摸索

4、最佳铺板的脾细胞数分别在96孔圆底板中加入如下细胞数（/孔）:12×105、6×105、3×105、1.5×105和0.75×105,每一个细胞梯度中均加入BI1640培养[5]。为避免边缘效应的产生,培养板周围各孔中只加入200μL无菌PBS[6]。37℃细胞培养箱孵育60h。1200r/min水平离心机离心10min,每孔中弃100μL培养上清,然后加入10μLMTT（5g/L）。37℃避光孵育4h。1200r/min水平离心机离心10min,每孔中弃80μL培养上清后加入200μLDMSO。平板振荡器上振

5、荡,约4h后孔底结晶颗粒消失,用酶标仪检测A578值。　　1.2.2简化DMSO加入条件用含100mL/LFBS的100μLRPMI1640培养脾细胞。刺激时间结束后,在每孔中直接加入10μLMTT（5g/L）。37℃避光孵育4h后不弃上清,分别加入100μL或150μLDMSO。振荡溶解20min,扫描平板,酶标仪检测A578值。　　1.2.3比较培养液用量对细胞培养的影响分别用100μL或200μL培养液培养BTT的量同上。避光孵育结束后,分别直接加入100μL或150μLDMSO。振荡溶解20min,扫描

6、平板,检测A578值。　　1.2.4摸索BTT（5g/L）。37℃避光孵育4h后,每孔中加入150μLDMSO。震荡溶解20min,酶标仪检测A578值;（2）时效关系实验:为保证各检测时间点刺激结果的可比性,在同一96孔平底板上,用3mg/LBTT检测同（1）。　　2结果　　2.1最佳铺板脾细胞数的确定在96孔圆底培养板中加入不同数量的小鼠脾细胞,观察BTT后形成的甲瓒（Formazan）颗粒即使震荡4h,仍不能完全溶解。复孔间A值误差大,推测可能为脾细胞在U型板底聚集使得颗粒溶解不彻底。以下实验中改用平底板

7、培养脾细胞,以减少溶解不彻底造成的误差。　　图1最佳脾细胞数的确定（略）　　Fig1Determinationofoptimalsplenocytesnumbers　　2.2实验体系的优化在上述反应体系中,加入DMSO溶解颗粒之前需要吸弃部分培养液,为了减少由此步操作对实验造成误差的可能性,在100μL培养液中直接加入DMSO。结果发现,100μLDMSO不足以完全溶解formazan颗粒,而150μLDMSO直接加入含100μL培养液中可完全溶解MTT所形成的formazan颗粒,A值远远高于100μLDMS

8、O孔（图2）。　　图2简化MTT反应体系的尝试（略）　　Fig2ExplorationofsimplifiedMTTmethod　　2.3实验体系的确定为了进一步确定BTT反应条件,采用等量BSO对测定A值的影响,结果显示:用含100mL/LFBS的200μLRPMI1640培养脾细胞、150μLDMSO溶解Formazan颗粒可以获得最佳结果（图3）。因此,BTT反应条件确定为:96