日本血吸虫(中国大陆株)尾蚴的性别鉴定

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1、登记序号项目编号科研设计书项目名称：日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究承担单位：单位地址：邮政编码：开户行：帐号：1103021109000077488项目负责人：电话：职务职称：填报日期2004年7月28日江苏省地方病协会二○○四年制立项依据：血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体（ZW），雄性为同配子体（ZZ）。尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉眼区别，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝

2、、肠或粪便收集虫卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。然而，单性雌性尾蚴不能发育到完全成熟的成虫，给鉴别带来一定困难。同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育成熟至少需3周。采用分子生物学的方法，可快速鉴定尾蚴的性别。代表性差异分析（RDA）方法是基于递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基因组间差异性片段。由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄

3、性为同性配子体（ZZ），而雌性为异性配子体（ZW）。RDA方法从宏观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z，从而获得W染色体。DrewA.C.等（1995）采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用Southernblot方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组DNA特异性杂交。W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列W1设计出一对引物W1a和W1b。直接加入该引物对单个尾蚴作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。结果雌性尾蚴呈现扩增产物PCR-W1条带，雄性尾蚴

4、不呈现扩增条带。此方法能快速、可靠地用来鉴定曼氏血吸虫尾蚴的性别。基于曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定的现有方法，为探索适合日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法提供了理论和方法依据。利用代表性差异分析（RDA）方法，分离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性序列制备成DNA探针，用Southernblot方法鉴定日本血吸虫尾蚴性别。也可对此特异性序列进行测序，设计一对引物，对单个尾蚴的DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾蚴呈现扩增条带，雄性则不呈现扩增条带，从而用PCR方法可快速鉴定日本血吸虫单个尾蚴的性别。研究日本血吸虫尾蚴的性别鉴定技术，建立日本血吸虫

5、尾蚴快速鉴定应用技术有助于血吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研究；对血吸虫病疫苗评价方法的标准化、遗传学的研究；及其流行病学、感染诊断和病理学研究结果的正确评价；不同性别尾蚴的易感性和感染比率以及减虫率（减雌率）和减卵率的正确评估等均具有重要的意义。同时为进一步开发适合我国国情的日本血吸虫尾蚴性别鉴定试剂盒打下基础。一、主要研究内容、关键技术、目标：1、研究内容1.1用代表性差异分析方法获得日本血吸虫雌性基因组DNA特异性序列。1.2对特异性序列测序，设计引物，PCR扩增。1.3实验室内建立一种简单、快速的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。2、关键技

6、术2.1日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取2.2代表性差异分析方法（RDA）和PCR。2.3低熔点凝胶回收雌性特异性片段2.4大肠杆菌E.coliTG1感受态细胞的制备技术、DNA的重组和克隆筛选、重组DNA的转化及质粒DNA的提取。2.5DNA探针的制备和Southernblot验证方法2.6雌性特异性序列测序和引物设计。3、目标建立一种简单、快速、灵敏的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。二、研究方法及技术路线1.用传统方法确定尾蚴的性别，获取单性尾蚴样本1.1以逸蚴法筛选出阴性钉螺用于感染，所有用于实验的螺均筛选3次。1.2以单只毛蚴感染单只

7、钉螺；螺感染后在光照培养箱中养殖90天或在春夏季室温条件下养殖100天。逸蚴法筛选出阳性钉螺，取单性尾蚴感染小鼠，35天后剖杀，取成虫确定尾蚴的性别。并分别收集单性尾蚴分别编号保存于-70℃液氮备用。2.用代表性差异分析方法分离日本血吸虫雌性特异性序列2.1感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾蚴。45天后剖杀家兔，收集成虫，在解剖镜下将成虫雌雄分开，分别保存于-70℃液氮中备用。2.2取雌虫、雄虫各200条用基因组DNA提取试剂盒分别提取雌虫和雄虫的基因组DNA。2.3用限制性内切酶HindⅢ对雌虫、雄虫DNA进行酶切。将酶切产物与两条

8、适配子（RHind24,5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’和RHind12,5’-AGCTTGCGGTGA-3’）组成的接头