snt 2641-2010 食品中常见致病菌检测 pcr-dhplc法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!%$%食品中常见致病菌检测$%&'()$*%法(+,+-,./0/123,4/5+0.01//6"$%&'()$*%7+,4/6!%$%'$$'%$发布!%$$'%&'%$实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６４１—２０１０前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出

2、入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：曹际娟、郑秋月、徐君怡、黄晓蓉、耿丽梅、孙哲平、王旭、于畅、邵碧英、郑晶、杨春华、王振国、高晓博。Ⅰ犛犖／犜２６４１—２０１０食品中常见致病菌检测犘犆犚犇犎犘犔犆法１范围本标准规定了食品中沙门氏菌等３０种致病菌的ＰＣＲＤＨＰＬＣ检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等３０种致病菌的快速检测。注：３０种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、

3、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件

4、。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷酸三磷酸ＤＨＰＬＣ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）：变性高效液相色谱ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式

5、反应犜犪狇（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌）：水生栖热菌ＴＥＡＡ：三乙基铵醋酸盐４生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。５废弃物处理和防止污染的措施５．１检测过程中的废弃物需经１２１℃高压灭菌处理至少３０ｍｉｎ后再弃置。５．２检测过程中防止交叉污染的措施参照标准ＧＢ／Ｔ２７４０３执行。１犛犖／犜２６４１—２０１０６原理ＤＨＰＬＣ分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对ＤＮＡ片段进行分离。离子对采用三乙基胺醋酸盐缓冲溶

6、液（ＴＥＡＡ），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与ＴＥＡＡ分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时ＴＥＡＡ分子中的三个乙基与固定相Ｃ１８表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。７试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。７．１犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。７．２ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。７．３１０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒ

7、ｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４），２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。７．４引物：引物序列见附录表Ａ．１。７．５ＴＥ溶液。７．６１０％ＳＤＳ。７．７蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。７．８氯化钠（ＮａＣｌ）：５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。７．９１０％ＣＴＡＢ。７．１０三氯甲烷。７．１１异戊醇。７．１２酚。７．１３异丙醇。７．１４７０％乙醇。７．１５ＤＨＰＬＣ缓冲液：缓冲溶液Ａ为５０ｍＬＴＥＡＡ和２５０μＬ乙腈混合，加水定容至１０００ｍＬ；缓冲溶液Ｂ为５０ｍＬＴＥＡＡ和２５０ｍＬ乙腈混合，加水定容至１００

8、０ｍＬ；缓冲溶液Ｄ为７５％乙腈。８主要仪器和设备８．１ＰＣＲ仪。８．２ＤＨＰＬＣ仪。８．３高速离心机：离心转速１８０００犵。８．４ＰＣＲ超净工作台。８．５微量可调移液器和灭菌吸头：２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。８．６灭菌ＰＣＲ反应管。９方法提要与检测程序９．１方法提要本方法利用ＤＨＰＬＣ非变性条件下的ＤＮＡ分离技术，灵敏地检测ＰＣＲ扩增产物进行细菌鉴定分析，不同的细菌显示特异的ＤＨＰＬＣ