snt 2969-2011 国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２９６９—２０１１国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法犚犜犘犆犚法犇犲狋犲犮狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉犲犪狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆犪狉狋—犚犜犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法犚犜犘犆犚法ＳＮ／Ｔ２９６９

2、—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．５字数９千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６６８定价１４．００元版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６９—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检

3、验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：薛芳、孙时、耿丽梅、田虹、宋锋林、张晓龙、高玉峰、孙立新、吴忠华、郭天宇。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６９—２０１１国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测方法犚犜犘犆犚法１范围本标准规定了国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测对象、生物安全要求、样品的保存运输、检测方法和结果判断。本标准适用于国境口岸蚊类携带东部马脑炎病毒的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件

4、，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部，２００６年）３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１东部马脑炎病毒犲犪狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊；犈犈犈犞东部马脑炎病毒属披膜病毒科甲病毒属，病毒粒子呈圆形，核衣壳呈２０面体对称，直径５０ｎｍ～７０ｎｍ，含有一个高电子密度的核心，是引起人类东部马脑炎的病原体。黑尾赛蚊（犆狌犾犻狊犲狋犪犿犲犾犪狀狌狉犪）、盐泽伊蚊（犃犲犱犲

5、狊狊狅犾犾犻犮犻狋犪狀狊）等蚊虫为本病毒的主要传播媒介。４检测对象出入境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。５生物安全要求实验室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行。６器材与试剂６．１器材液氮罐、冷藏箱、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、ＰＣＲ扩增仪、烘箱、水浴锅、生物安全柜、匀浆器、移液器、ＰＣＲ反应管、冻存管、离心管、塑料平皿、镊子等。１版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６９—２０１１６．２试剂Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、引物、缓冲液、混合

6、酶、ＲＮＡ酶抑制剂等。７样品的保存运输７．１样品的分拣、分装将捕获的蚊虫现场用二氯甲烷熏杀后，快速分拣。若条件允许，分拣过程应在简易低温装置上进行。分拣后按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。７．２样品的保存运输（物理法）分装完毕的样品，尽快装入液氮罐、冷藏箱或其他适当的冷冻（冷藏）装置，尽早送实验室处理。若采样点与实验室相距较近，也可将活体样品连同采样工具直接送实验室处理。运送过程中防止蚊虫逃逸。７．３样品的保存运输（化学法）在装有蚊虫的密

7、闭容器内加入５倍体积的ＲＮＡ保护剂，常温下５ｄ内送达实验室。８样品的检测８．１核酸（犚犖犃）提取８．１．１犚犖犃提取方法使用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ。可参照如下方法提取总ＲＮＡ，或使用可达到同等效果的ＲＮＡ提取试剂盒：８．１．１．１取蚊虫个体（单只或多只）放入１．５ｍＬ离心管内，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂后研磨成匀浆，室温放置５ｍｉｎ。８．１．１．２加入２００μＬ二氯甲烷，剧烈振荡１５ｓ，室温放置３ｍｉｎ，于４℃１２０００犵离心１５ｍｉｎ。８．１．１．３小心吸出上清液，置于另一１．５ｍＬ离心管中，加入异丙醇５００μＬ，室温放置１０ｍ

8、ｉｎ，４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。８．１．１．４弃上清液，加入７５％乙醇１ｍＬ洗涤，４℃７５００犵离心５ｍｉｎ。８．１．１．５弃上清液，将沉淀自然干燥，加入适量的ＤＥＰＣ水溶解沉淀。８．１．１．６－７０