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1、优化牛体外生产胚胎条件的研究草食家畜(季刊)2007年6月第2期(总第135期)优化牛体外生产胚胎条件的研究张金花,海里且木,陈静波(1.新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052;2.新疆畜牧科学院畜牧所,新疆乌鲁木齐830000)摘要:为优化牛体外培养系统,本研究利用微滴培养法,探讨了卵巢状态所获卵母细胞,种公牛个体,受精时间,季节及共培养对体外培养结果的影响.结果表明:(1)不同卵巢状态所获卵母细胞的分裂率,囊胚率差异均不显着(P>0.05);(2)不同种公牛精液进行体外受精,结果显示分裂率和囊胚率差异
2、显着(P<0.05);f3)6h,8h,12h和16h受精时间比较,结果以12h效果最佳,分裂率,囊胚率与其它各组均差并显着(P<0.05).(4)春,秋季体外培养的效果显着优于夏,冬季.(5)使用颗粒单层可显着提高囊胚率(P<0.05).关键词:卵巢;精液;季节;颗粒单层中图分类号:S814.4文献标识码:A文章编号:1003—6377(2007)02-0027—04自牛体外受精获得第一头试管牛以来,已对牛卵母细胞的体外成熟OVM),体外受精(IVF)和早期胚胎的体外培养(IVC)进行了大量研究,已建立
3、了比较完善的方法[1】.但是,由于影响牛胚胎体外生产(IVP)的因素多而且复杂,同一个系统和方法在不同实验室表现不同,有些影响因素不明确,经过IVM虽然多数的卵母细胞可以成熟,但经过IVF和IVC后,成功的培养系统也仅有20%～40%可以发育至囊胚阶段阁.目前的培养效率还未达到理想效果,卵巢资源利用率低,影响了体外胚胎生产的产业化.本研究从五个方面对体外培养进行了优化比较研究.1材料和方法1.1试剂TCM一199,丙酮酸钠,牛磺酸,雌二醇(Sigma公司产品),E一22570,P一5280,LH,FSH(宁波激素制药厂)等
4、.1.2卵巢和卵母细胞的采集牛卵巢采自乌鲁木齐市天鹰屠宰场,置于37~(2无菌生理盐水中保存,用连有12号针头的10ml注射器吸卵巢表面直径为2-6mm卵泡的卵母细胞,在体视显微镜下捡卵.收稿日期:2007—05—10基金项目:新疆科技攻关项目《肉奶牛胚胎产业化及高效繁育体系的建立》,项目编号:200131102作者简介:张金花(1981一),女,新疆人,硕士研究生,研究方向:动物遗传育种与繁殖.通讯作者:陈静波(1956一),男,研究员,博士,研究方向:动物遗传育种与繁殖.1.3卵母细胞成熟培养从形态学上将卵母细胞分为4
5、级.A级为卵丘细胞致密,无扩散,细胞质均匀,形状规则,至少有3层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞;B级为1-3层卵丘细胞包裹的卵母细胞;C级为半裸卵,卵母细胞外有部分卵丘细胞存在:D级为裸卵,变形卵,包括退化的卵母细胞.只选择A,B级卵母细胞用于成熟培养.将清洗好的卵母细胞置于培养条件为5%C0,38.5℃,饱和湿度条件下成熟培养22-24h.1.4精液获能处理及受精精液获能使用TALP液上游法进行处理,最终受精精子浓度调整至1-9x106/ml,受精液滴体积为70l,受精卵的培养液体积为2001~1,均覆盖石蜡油.1.5颗粒单
6、层的制备采集完COCs后,取剩余的含颗粒细胞的卵泡液lml,用胚胎培养液以1500rpm/min离心5min清洗,沉淀物用5ml培养液悬浮后,再次离心,沉淀物用培养液悬浮,加入培养液滴,并将其最终浓度调整为lx106个/ml,约12h后观察,贴壁后有约60%的细胞汇集则可用.1.6受精卵培养将受精卵转移至胚胎培养液中,受精后20h观察第二极体,受精后48h统计卵裂率,每48h半量更换培养液,6—7d后统计囊胚率.1.7统计分析建立数据库,统计分析用spsslO.0进行数据处理.2结果2.1卵巢状态对体外培养结果的影响(见表
7、1)272007年6月第2期(总第135期)草食家畜(季刊)表1的结果显示卵巢黄体侧或对侧体外培养的分2.2种公牛个体对体外培养结果的影响(见表2)裂率和囊胚率差异均不显着(P>O.05).表2公牛个体精液对体外培养结果的影响表2结果显示使用符合国家标准的种公牛冷冻精液个体问的受精有差异,且差异显着(P<O.05o因此在进行体外培养时需进行精液受精力的测定,尽可能选取受精效果好的种公牛精液.2-3受精时间对体外培养结果的影响(见表3)表3受精时间对体外培养结果的影响表3结果显示精子与卵母细胞共孵育不同的时间上对
8、体外培养的效果无益处.以12h为宜,68h的效果较差,而受精时间大于12h以2.4季节对体外培养结果的影响(见表4)表4季节对体外培养结果的影响表4结果显示不同季节体外培养的结果,以秋季的2.5颗粒细胞共培养对体外培养的结果的影响(见表5)效果最好,春季次之,而夏季和冬季的效果较差(P<o.05)
