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1、实验一总RNA的提取1.1实验原理本实验采用试剂公司商品化的总RNA提取试剂盒。该RNA纯化系统采用RNA酶抑制剂,异硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇,实验的整个操作都在冰浴条件下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。然后根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法原理,采用酸性酚-氯仿混合液抽提，再进一步从复合体中纯化RNA。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙
2、醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐。1.2操作步骤1.2.1细胞或组织破碎：植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织)(1)将1000ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。(2)将0.05克新鲜组织用液氮冰冻处理。(3)在液氮下,研磨冷冻的植物组织块。(4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管(最好是预冷冻)中,匀浆破碎细胞。1.2.2RNA的抽提(1)RNP的分离，向离心管内的组织液中加入1ml的裂解液，15℃－3
3、0℃放置5分钟。(2)加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒，室温放置3分钟,转移至无菌离心管离心,4℃，12000g,10分钟。(分三层)(3)将上层水相吸至无菌离心管中+等体积70%的乙醇,混匀，转移到吸附柱中（洗涤除去其中的盐类），4℃离心，10000g,30秒，弃去废液。(4)加入0.5ml的去蛋白液，再以4℃离心，10000g,30秒，弃去废液。(5)加入0.7ml的漂洗液，4℃离心，10000g,半分钟，弃去废液。(6)加0.5ml漂洗液,离心两分钟,弃废液.(7)将离心柱转移到新的离心管中，加入50ul的DEPC水，静置2分钟，4℃离心，
4、10000g,2分钟，收集离心下来的液体，即为所提取的RNA样品。1.3结果经过电泳图像分析大致共出现三条带，即28S、18S以及mRNA弥散带，结果表明RNA提取比较成功。-24-1.3讨论RNA的提取过程有五点最为关键，１）样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地使核蛋白复合体变性；３）对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。故应做到：1、研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液
5、氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。2、变性液及相应的离心管需预冷。3、加入变性液后需用力摇动或上振荡器,摇动或振荡时间0.5-1min。4、在进行RNA提取的整个过程中要佩戴手套和口罩，防止认为的RNA酶污染，导致RNA的降解。所有要使用的器皿必须经过适当的处理才可使用。实验二RT-PCR实验1.1实验原理利用RT－PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径之一。RT－PCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克隆，即可实现基因的分离。RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，目前已经有多种操作方法。本实验采用“两步法”进行。（1）MMLV、
6、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/Ｔaq酶系统，在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。（2）TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统，在此系统中，TthDNA聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA[乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn的存在将抑制T
7、thDNA酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。1.2实验操作１：总RNA及mRNA的提取（见实验一）２：cDNA第一条链的合成（1）：变性及退火mRNA11ul特异引物1ul补水至20ul90℃1min50℃5min,冰浴（2）按下表加入各反应成分5×扩增缓冲液4μl４种dNTP混合液２μl50mMMgCl21ulDTT1ulRNA酶抑制剂２０单位（1ul）-24-MMLV200单位(1ul)加水至20μl（3）：42℃反应３０分钟（4）：于９５℃加热５分钟，灭活反转录酶3：PCR扩
8、增按下表加入：１0×扩增缓冲液5uldNTP1ul上游寡核苷酸引物10-50pmol(1ul)下游寡核苷酸引物10-50p
