微流控芯片电泳在尿蛋白分离中的应用论文

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1、微流控芯片电泳在尿蛋白分离中的应用论文褚少朋，王惠民，宋宏伟，丛辉，王跃国，张芹，张志泉，徐耀忠.freelplesplesorethan++inandglobulin.TheresultsericanHelenaagarosegelelectrophoresis.Results:Noproteinpeakplesofthecontrolgruop,butproteinpeaksplesofthecasegroupongthem16eresultasAmericanHelenaagarosegelelectrophoresisanditsacc

2、ordrateinclinicethodtoseparateproteinuriainmiddleandsmallhospitals.Keyicrofluidicchip;Electrophoresis;Urineproteins;Selectivityofproteinuria尿蛋白增多可来源于多种疾病，尿蛋白电泳有助于病因诊断及病情严重程度判断。常用的尿蛋白电泳主要有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。SDS-PAGE应用最为普遍，可分离出不同分子量的蛋白质，但该法操作极为繁琐，花费时间较长。

3、近年来国外把毛细管电泳(CE)1用于分离尿蛋白，虽操作简便、快速，但需要昂贵的仪器，限制了临床的广泛推广。近几年发展起来的微流控芯片技术2具有高效、快速、试样用量少、散热能力强等优点。并可实现阵列并行操作,用于无机分子、有机分子、生物大分子(如DNA、氨基酸、蛋白质、细胞)、细菌及病毒等的分析检测已有较多研究报道，但鲜见在临床上用于分离尿蛋白的报道，我们自行研制了微流控电泳芯片，并用于分离临床尿蛋白的验证试验，效果很好，与美国Helena琼脂糖凝胶电泳结果100%相符，与临床诊断符合率为97.14%。1材料与方法1.1对象(1)病例组：上海第二

4、军医大学附属长征医院住院患者70例中,男40例，女30例,年龄24～89岁。其中尿毒症14例，慢性肾炎21例，慢性肾衰4例，肾病综合症2例，多发伤2例，糖尿病等27例。留取尿蛋白定性在++以上的晨尿标本70份。（2）对照组：健康人晨尿标本30份，无肾脏病史及其他慢性病史，尿蛋白定性试验为阴性。1.2试剂与仪器（1）试剂：纯人白蛋白、人运铁蛋白、人IgG购自美国Sigma公司，SP300plate琼脂糖凝胶电泳试剂盒购自美国Helena公司。75mmol/L硼酸盐(pH10.55)含0.8mmol/L乳酸钙、1%(v/v)乙胺电泳缓冲液用双蒸水配

5、制，使用前经0.2μm滤膜过滤，并真空抽气。（2）仪器：REP全自动电泳仪，美国Helena公司。自制微流控芯片：整个石英芯片尺寸为64mm×32mm，芯片微管道宽约70μm，深约40μm，芯片进样池到十字交叉点长4mm，有效分离长度为42mm，储液池直径为2.5mm。电泳仪与检测系统为中科院微系统与信息技术研究所自制3,4，该系统可调输出电压为0～5000V，利用214nm紫外检测器检测蛋白浓度，软件为自行设计。1.3方法1.3.1尿标本预处理取尿样5ml置分子量为7000透析袋中，于1L75mmol/LpH10.3硼酸盐缓冲液中透析1小时，

6、于聚乙二醇20000中浓缩至干，用0.5ml双蒸水洗出，磺基水杨酸-硫酸钠比浊法测定蛋白质含量。1.3.2电泳与检测新制芯片分别用1mol/LNaOH、双蒸水、电泳缓冲液浸泡30min。每次电泳前分别用1mol/LNaOH、双蒸水、电泳缓冲液冲洗芯片管道1min并使电泳缓冲液充满进样与分离管道，在样品池加4μl待测尿蛋白样品。进样时，进样管道两端加500V电压，分离管道两端悬空，进样15s。分离时进样管道两端悬空，分离管道两端加1500V电压，电泳4min。仪器在214nm自动记录蛋白区带信号，并对时间描出电泳图谱。1.3.3Helena琼脂糖

7、凝胶电泳从SP300plate琼脂糖凝胶电泳试剂盒中取出胶片置于电泳槽上，点尿样3μl，在21℃、350V条件下电泳8min，然后在60℃烘干11min。取出胶片置于染色槽内染色、脱色、透明、自然凉干后在525nm扫描，仪器自动描出电泳图谱。1.3.4判断蛋白尿的选择性分别计算白蛋白、球蛋白的峰面积，以白球蛋白的峰面积之比判断蛋白尿的选择性，如比值大于5，则为选择性蛋白尿；反之则为非选择性蛋白尿。2结果2.1微流控芯片电泳成份分辨力取4μl(纯人白蛋白、人运铁蛋白、人IgG各4g/L)3种标准蛋白混合溶液放在微流控芯片中进行检测。如图1所示，3

8、种标准蛋白获得基线分离，人IgG首先出峰，人运铁蛋白其次，人白蛋白最后出峰。2.2微流控芯片电泳重复性将浓度均为5.0g/L的纯人白蛋白与人运铁蛋白标