扇贝多肽经smacxiap通路抑制uvb诱导hacat细胞凋亡的作用论文

扇贝多肽经smacxiap通路抑制uvb诱导hacat细胞凋亡的作用论文

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1、扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用论文张兰兰苏爱刘颖孙谧王春波杜卫【摘要】目的探讨扇贝多肽(PCF)经半胱天冬酶激活物(Smac)和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)通路对抑制中波紫外线(UVB)诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法实验分为如下6组:正常对照组(A组)、UVB模型组(B组)、UVB+1.42mmol/LPCF组(C组)、UVB+2.84mmol/LPCF组(D组)、UVB+5.68mmol/LPCF组(E组)和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组(F组),分别进行相应处理。分别采用琼脂糖

2、凝胶电泳和Hochst33258染色法测定各组细胞凋亡率,蛋白印迹法(EM(Gibco公司)、体积分数为0.10的标准胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、100kU/L青霉素和100kU/L链霉素组成;PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化,纯度96%,蒸馏水配制成227.5mmol/L的储存液,过滤除菌,4℃保存备用;DNALadder抽提试剂盒、Hoechst33258染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;RNAisoReagent、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品;Smac抗体购自eBioscien

3、ce;XIAP抗体购自CellSignalingTechnologyTM(Beverly,.freelmol/LPCF组(C组)、UVB+2.84mmol/LPCF组(D组)、UVB+5.68mmol/LPCF组(E组)和UVB+5.68mmol/L维生素C阳性对照组(F组)。将细胞种入置有盖玻片的6孔培养板内培养,细胞融合至50%~80%时,按实验分组进行处理。C、D、E组细胞在含有不同剂量PCF的培养液中预孵育2h后,UVB照射(剂量20mJ/cm2);F组细胞在VitC浓度为5.68mmol/L的培养液中预孵育2h后,UVB照射(剂量20mJ/cm

4、2),照射结束后继续常规培养。1.2.2Hoechst33258染色检测细胞凋亡各组细胞UVB照射结束后继续培养18h,吸尽各孔培养液,按照Hoechst33258染色试剂盒说明进行操作,荧光显微镜下观察结果。同一处理组随机选择6个观察视野,每个视野观察200个细胞,计数凋亡细胞数,重复3次,计算细胞凋亡率。1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡将细胞按实验分组处理后,继续培养18h。然后收集细胞,按照DNALadder抽提试剂盒说明进行操作。将获得的DNA应用20g/L琼脂糖凝胶电泳。1.2.4蛋白印迹法(RTreagentkit说明逆转录为cDNA备用

5、。XIAPcDNA引物序列分别为:上游为5′ATATACCCGAGGAACCCTGCC3′,下游为5′TTCCGGCCCAAAACAAAGA3′,扩增片段长度为245bp;内参GAPDH的引物序列分别为:上游为5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′,下游为5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′,扩增片段长度为509bp。按照PCRAmplificationkit说明进行反应。扩增条件为:95℃预变性3min;94℃40s、60℃40s、72℃40s,循环35次;最后72℃延伸3min。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR

6、产物,实验重复3次。采用凝胶分析软件Quantityone进行半定量分析,XIAPmRNA的表达水平以XIAP与GAPDH比值表示。1.3统计学分析用SPSS12.0软件进行数据处理,数据间比较采用单因素方差分析。2结果2.1PCF抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡作用琼脂糖凝胶电泳结果显示,B组有明显的DNA梯形条带,且梯形带灰度较高,A、F组及加入PCF各组(C、D、E组)均未见明显的梯形条带(图1)。图1DNALadder琼脂糖凝胶电泳图(略)M:2000bpDNAMarker;A:正常对照组,未见梯形条带;B:UVB模型组,可见明显的梯形条带;C:

7、UVB+1.42mmol/LPCF组,未见明显的梯形条带;D:UVB+2.84mmol/LPCF组,未见明显的梯形条带;E:UVB+5.68mmol/LPCF组,未见明显的梯形条带;F:UVB+5.68mmol/LVitC阳性对照组,未见梯形条带显微镜下,A组细胞核形态规则,表面光滑,发出均匀的微弱的蓝色荧光;B组细胞核致密浓染,呈现核浓缩、边缘化或碎裂,发出亮蓝色荧光。F组及C、D、E组细胞核致密浓染,核浓缩、边缘化或碎裂的细胞数量明显减少。B组与A组比较,细胞凋亡率明显增加(F=165.096,q=36.535,P0.01),预先加入药物各组(C、D

8、、E、F组)与B组比较,细胞凋亡率减少,差异有显著性(q=11.369~28.5

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