最低抑菌浓度(mic)测定

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1、-2--2-附件3.4最低抑菌浓度（MIC）测定1.菌悬液的制备刮取18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨后混悬于1ml缓冲液中，借助比浊仪，调菌悬液浓度至104/ml，于1小时内用多点接种仪接种（放置室温应大于25℃）。2.MIC测定(1)抗菌药物储存液制备n抗菌药物称量及配制：根据各抗菌药物的纯度称取，以目前所用抗菌药物为例。抗菌素纯度称量（mg）加溶剂(ml)储存液浓度(mg/ml)四环素100%3.213200大观霉素63.4%40.38125600头孢曲松81.5%2.4512000环丙沙星84.43.813200n分装与保存：每管200ml，-70℃可保存

2、一年。(2)抗菌药物工作液制备青霉素：管号原液01110987654321浓度(mg/ml)32001600800400200100502512.56.253.121.560.78取量(ml)200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200溶剂(ml)20020020020020020020020020020020020020028四环素:管号原液01浓度(mg/ml)32001600800取量(ml)200→200→200溶剂(ml)200200200大观霉素：管号07654321浓度(mg/ml)25600128

3、00640032001600800400200取量(ml)200→200→200→200→200→200→200→200→溶剂(ml)200200200200200200200200头孢曲松:管号原液010987654321浓度(μg/ml)2000200100502512.56.253.121.560.780.40.2取量(μl)40→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200溶剂(μl)36020020020020020020020020020020020028环丙沙星：管号原液013121110987654321浓度(u

4、g/ml)32001600800400200100502512.56.253.121.560.780.40.2取量(μl)200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200→200溶剂(μl)200200200200200200200200200200200200200200200(1)抗菌药物梯度培养皿的制备n培养皿编号：按各抗菌药物浓度编号。n将配制好的各抗菌药物工作液150μl加到各培养皿中，与15ml50℃预温的培养基充分混匀，平放在超净台内，半开培养皿盖至培养基凝固后，用塑料袋密封保存于4℃冰箱。(2

5、)菌悬液接种与培养n多头接种针以及菌液板用高压法灭菌处理，其他配件用酒精消毒处理；使用前必须确认完全烘干。n按照仪器要求将菌悬液接种于各抗菌药物梯度培养皿，接种菌后置超净台内直至菌悬液渗入。n置35℃～36℃、5%～10%CO2一定湿度的环境中培养。n记录放置时间。n培养18～24小时观察结果。(3)结果判读n观察细菌生长情况：-记录结果读取时间。-在适宜的光线下，观察对照培养皿的菌落生长情况，并对所有菌株进行初步鉴定（涂片染色和氧化酶试验）。-比较观察对照平皿和抗菌药物平皿，进行判读：接种点内有1个以上菌落或呈菌苔状为生长；接种点内无任何菌落或呈薄雾印迹为无生长。28

6、nMIC判读与记录：-MIC是指抗菌药物能够抑制细菌生长的最小抑菌药物浓度，表示单位为mg/ml。-记录各抗菌药物浓度平皿上细菌生长情况，在《WHO参考菌株及MIC实验结果记录表》用（+）表示生长，（-）表示无生长。-每批实验结果必须由另外一名技术人员复读、签字，以确保结果的准确性。n参考菌株的判读：-本次测定的参考菌株MIC值在标准MIC值范围内或在标准MIC值±1个浓度范围内表明本次试验有效。-本次测定的参考菌株MIC值超出上述范围则表明本次试验无效，需重新配制抗菌药物平皿和测定。1.b－内酰胺酶测定(1)纸片酸度定量法n将一小片滤纸置于空平皿中：n让滤纸吸足青霉素

7、液（pH值8.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液100ml+0.2g溴甲酚紫+5g无缓冲剂的结晶青霉素）：n用接种环将10～20个菌落涂到滤纸上，涂膜直径约为5mm，35℃孵育30分钟：n观察结果：产生b－内酰胺酶的淋球菌使滤纸颜色由紫变黄。(2)产色头孢菌素法将头孢硝噻吩纸片置于空平皿中，用接种环将菌落涂到纸片上，3分钟内观察有无颜色变化，变红者为b－内酰胺酶阳性。28附件3.5WHO参考菌株及淋球菌临床分离株MIC实验结果记录表记录时间：实验人员：核读人员：①青霉素（P），②四环素（T）及b－内酰胺酶：平皿号P1P2P3P4P5P6P