大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(jin lab)

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1、大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinQuan-WenLabatXMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1.用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5mlLB液体培养基的培养管中，可以准备两管。37°C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。2.高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。3.准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。第二天：1．取2-5ml过夜培养液，接入500mlLB(或2XTY)液体培养基中,控

2、制起始OD600=0,03-0,05。37°C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.4时，停止培养。2．将菌液在冰上预冷30分钟。同时，开启离心机，预冷至4°C。3．随后将菌液分装到250ml或500ml预冷的离心瓶中，4°C，4000rpm离心15分钟。4．弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。4°C，4000rpm离心15分钟。5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细

3、胞悬浮约500ml冰水中。4°C，4000rpm，离心15分钟。6．弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。4°C,4000rpm,离心10min。7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。8．将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70°C冰箱中保存。9．检测转化效率：取100ml新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmidDNA，电转化后，将重悬在1ml

4、SOC培养液并复苏的细胞分别取10ml(1%)和100ml(10%)涂板，估测转化效率。*Optimalefficiencyisca.1X108cfu/µgDNAforgeneralcloning.**Forlibrarytransformation,efficiencywithca.1X109cfu/µgDNAisrequired.感受态细胞制备简要流程：收集细胞à冰水冲洗细胞2次à10%甘油冲洗细胞1次à重悬细胞在10%甘油à分装二、电转化[连接产物、纯化质粒或质粒文库]：1．从-80°C冰箱中取出感受态细胞，置

5、于冰上解冻。2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。3．将解冻的感受态细胞按照40～100ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置。4．取1-2µl纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的离心管中，冰上放置10min。[加入的DNA体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！]5．打开电转仪[Bio-RadGenePulserSystem]，调至Manual，调节参数设置为25µF,200OHMs,电压为2.0kV[这些参数设置可以根据经验略作调整]。6．将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混

6、合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。7．将电击杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X500ml的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。8．37°C，220－250rpm复苏1小时。9．离心，涂板，置于37°C，过夜培养，次日查看转化结果。三、电击杯的清洗和保存：1.用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入75%酒精冲洗。2．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10次以上。3．加入无水乙醇1-2ml于电

7、击杯中，浸泡5分钟。4．弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。5．将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用。几种可以选用的细菌培养基：200ml500ml1000mlLB1gyeastextract2gtryptone(orpeptone)2gNaCl2.5gyeastextract5gtryptone(orpeptone)5gNaCl5gyeastextract10gtryptone(orpeptone)10gNaCl2´TY3.2gTryptone2gYeastExtract1gNaCl[用5NNa

8、OH调pH值至7.0]8gTryptone5gYeastExtract2.5gNaCl[用5NNaOH调pH值至7.0]16gTryptone10gYeastExtract5gNaCl[用5NNaOH调pH值至7.0]SOC4gTryptone1gYeastExtract0.1gNaCl2mlKCl(250mmol/L)1mlMgCl2(2mo