分子生物学检验技术-第十章 生物芯片技术

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1、第十章生物芯片技术概述一、DNA芯片技术的概念基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。DNAChipTechnologySolidsupport(glass,plastic,metal,silicon)MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)Workonthebiochemicalprincipl

2、eofDNA/DNAhybridizationHybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled通常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片为生物芯片的一种：生物芯片包括：DNA芯片蛋白质芯片其它芯片按用途分样品制备芯片生化反应芯片检测芯片芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray二、DNA芯片的主要类型按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备

3、的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活ComparisonofDNAChipTechnologiesSensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationeff

4、iciency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)Oligo-ChipcDNA-ChipGenomicChip8nor20n<2,000n>50,000nsequencingexpressionexpressiongenomicanalysis第二节DNA芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备（一）支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸（二）原位合成芯片的制

5、备1.显微光蚀刻技术支持物表面活性基团连接有光敏保护基团（X）受到保护。产率较低原位合成(InSituSynthesis)Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupl

6、etotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.2.压电打印法压电毛细管喷射器产率较高喷墨打印技术（三）DNA微集阵列的制备方式：预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上探针的制备已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段人工合成的DNA片段单链、双链、DNA或RNA均可作为探针2.打印喷墨打印（非接触式点

7、样）优点、缺点针式打印（接触式点样）优点、缺点针式打印法（接触式点样）Best!3.探针的固化打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定二、样品的准备样品的分离纯化DNA,mRNA扩增PCR,RT—PCR，固相PCR标记等过程荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记三、分子杂交样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)——

8、是一类以氨