实验二 目的基因pcr扩增产物的克隆

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1、实验二　目的基因PCR扩增产物的克隆[实验目的]1．学习利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物；2．掌握基因克隆的基本操作过程3．了解利用T载体进行PCR产物克隆的基本原理4．进一步巩固PCR扩增及电泳检测技术。[实验原理]1.PCR产物回收在高离子盐存在的情况下，DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。2.T载体与PCR产物的连接源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组

2、合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA

3、连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接

4、酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到

5、短暂配对结构的稳定。TaqDNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与T-Vector末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。[实验材料、试剂和仪器]PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。[实验步骤]10×PCRBuffer2.5μldNTPs0.5μlTaq0.2μl引物11.5μl引物21.5μlddH2017.3μlDNA模板1.5μl1．PCR扩增　　PCR反应体系：　　　注：每组做5管，其中4管用于PCR产物

6、回收，1管作电泳检测时的对照PCR反应程序：194℃预变性　5min294℃变性45s360℃退火30s472℃延伸60s2－4步骤，35循环572℃延伸10min64℃保存2．目的基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测（1）制备琼脂糖凝胶称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml1.0×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（2）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。（3）将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。（4）将冷到60℃左右

7、的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。（5）待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。（6）加入电泳缓冲液至电泳槽中。（7）用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（8）接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。3．产物回收（1）在紫外光下将琼脂糖凝胶上的目的片段切下，放入1.5mLEppendorf离心

8、管中；加入500μl溶胶/结合液DB，充分混匀。（2）将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室温放置1min，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。（3）加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心