羊和牛的非胃溶菌酶的基本结构和性质

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1、羊和牛的非胃溶菌酶的基本结构和性质以及溶菌酶功能分歧的含义摘要：溶菌酶是从牛和羊肾的管家基因纯化而来的，并且对他们的氨基酸序列和一些酶的性质进行了测定。和大多数哺乳动物溶菌酶一样，牛和羊肾溶菌酶是由130个氨基酸组成的。这两种溶菌酶的序列彼此之间非常相似（95%的相似度），与传统哺乳动物像人、老鼠以及兔子的溶菌酶也很相似（74-85%的相似度），但是与他们自己的胃溶菌酶的相似度较低（65-70%的相似度）。牛肾溶菌酶与牛乳腺溶菌酶也不同，这表明牛包含了至少3种鸡蛋清溶菌酶，即肾、乳腺和胃溶菌酶。牛和羊肾溶菌酶在离子

2、强度为0.1、温度为30℃、PH为7的环境中对藤黄微球菌的活性分别是3%和29%，在PH为5.5、温度为40℃的环境中对乙二醇甲克素的活性分别为57%和84%（根据鸡蛋清溶菌酶，活性以百分比表示）。牛和羊溶菌酶在PH为7时的静电荷比人和鸡溶菌酶的正电位要低（牛和羊的非别为+1.5和+2.5，人和鸡溶菌酶的都为+8.0），并且他们与胃溶菌酶的更为接近（胃溶菌酶的为-2到0）。在牛和羊肾溶菌酶中观察到的静电荷位点较低的现象可能表明，反刍动物肾溶菌酶曾可以在祖先反刍动物的胃中作为消化酶。鸡蛋清型溶菌酶（c-溶菌酶）是一种

3、无处不在的酶，它可以水解某些细菌细胞壁中肽聚糖的p-1,4糖苷键这种酶已经经常被用作研究酶的功能、蛋白性质以及分子进化的模型。随着数据的积累，溶菌酶已经成为蛋白工程在酶功能、蛋白稳定性以及蛋白折叠中运用的目标。我们的目标之一就是将从各种器官中分离的天然溶菌酶的特征性信息呈现出来，因为这些信息对于通过基因工程提高性能的突变溶菌酶的设计很重要。牛羊等反刍动物的胃分泌的溶菌酶的含量很高，并且溶菌酶可以作为前肠发酵动物的培养细菌的消化酶。Jolle等人在牛胃的分泌物中纯化了3种同工酶，并且确定了牛胃2溶菌酶的序列。其余同工

4、酶的序列已经从他们的cDNA序列中推导出。至于羊胃溶菌酶，3种同工酶的序列也已经从他们的cDNA序列中推导出。牛和羊的胃溶菌酶序列（每种都有3种同工酶）之间非常相似，但却和其他常规哺乳动物（如人、鼠、兔）的溶菌酶不同（相似度不足70%）。牛和羊溶菌酶氨基酸序列以及cDNA序列的系统发育研究表明，反刍动物胃溶菌酶在反刍动物和其它哺乳动物在以多基因重复的方式在快速的协同演变发生了差异后发生演变。Dobson等人报道过，在牛中，溶菌酶在非胃组织以及分泌物中含量很少，并且非胃溶菌酶在电泳方式上不同于胃溶菌酶的形式。事实上，

5、White等人近来证实，在部分序列的基础上，牛乳腺溶菌酶与胃溶菌酶不同。因此，牛中不来自于胃和乳腺的溶菌酶的器官是否不同于肾溶菌酶。羊非胃溶菌酶的相关信息还未报道。因此，我们纯化了两种反刍动物牛和羊的肾溶菌酶，并确定了他们的氨基酸序列。这些氨基酸序列彼此之间非常相似，并且与其他哺乳动物的常规溶菌酶非常相似，但与其自身的胃溶菌酶不同。牛肾溶菌酶与牛乳腺溶菌酶也不相同。尽管牛的肾和胃溶菌酶序列存在差异，两者的酶却具有相似的净正电荷和相似的活性。非胃溶菌酶，包括在反刍动物中的这些溶菌酶的生物学功能以及进化历程都被加入了讨

6、论中。实验步骤实验中所有的材料和方法作为微型打印补充在后面。结果牛和羊肾溶菌酶的纯化和序列测定正如在补充材料中，我们纯化了牛和羊的肾溶菌酶，并且测定了他们的氨基酸序列。但值得注意的是，纯化的牛溶菌酶在纯化过程中色谱仪中发现了几个极峰。但是在羊的溶菌酶纯化过程中仅仅发现了一个峰值。牛和羊肾溶菌酶与人、鸡、牛胃2溶菌酶之间在酶学性质上的比较牛肾、羊肾、人、鸡、牛胃2溶菌酶在PH为7.0和6.2时，对藤黄微球菌的溶菌活性显示在表1中。牛肾溶菌酶和牛胃2溶菌酶表现得几乎不显活性（分别只占鸡溶菌酶的3%和1%），羊肾溶菌酶在

7、PH为7、离子强度为0.1的环境中活性占到了鸡的29%，同时，人溶菌酶的活性最高（占了鸡的396%）。然而，在PH为6.2、离子强度为0.023时，牛肾溶菌酶的活性占了鸡的129%，并且羊肾溶菌酶成为其中活性最高的（活性占鸡的389%）。在表1中，两种PH不同环境下的这些溶菌酶的静电荷也已显示出来，众所周知，细胞溶菌活性会随着溶菌酶正电荷与细菌细胞负电荷之间的静电反应而积累。鸡和人的溶菌酶相对正电荷量较高（>8.0），但是反刍动物溶菌酶的正或负电荷量很小。在不同离子强度分别为0.05和0.1时的牛和羊肾溶菌酶活性不

8、同所体现的PH依赖的特性驳斥了M.luteus（结果如图1图2所示）。在最适PH为5-8、离子强度为0.1时，与鸡溶菌酶相比，这两种反刍动物溶菌酶活性变化范围不大，最适酸性PH大约为5.2，并且随着最适PH值的慢慢增大，他们的最大活性在离子强度为0.05时比起在离子强度为0.1时增加将近1倍。这些特征与之前描述过的反刍动物溶菌酶极为相似。表1显示了这些溶菌酶