液相色谱分析方法的建立

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1、一.  方法建立的步骤二．开始前应知道1. 样品的性质在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。表 1 有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目化合物的化学结构（官能团）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光谱图化合物在样品中的浓度范围样品的溶解度样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有

2、信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。2.分离的目的HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；（2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%

3、，特别是不需样品预处理的情况。（4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？（5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？    方法建立实

4、验开始之前，应明确对方法的这些要求。三. 样品的预处理和检测  1.  预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：      （1） 可直接进样的溶液；:      （2） 需稀释、pH缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液；      （3） 必须首先溶解或提取处理的固体；。      （4） 样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害。   可直接进样的样品有操作方便、精密度好的优点，然而大多数HPLC分析的样品需称重或稀释定容后才能进样。当样品溶剂成分接近于流动相时，一般不会产生基线波动等问题，通常能够得到较好的结果。有

5、些样品在注入HPLC前需进行部分分离（预处理），以除去干扰物、浓缩样品或消除“柱杀手”，因此了解样品和各种被测物的浓度范围非常重要。  2.  检测：HPLC方法建立期间，在第一次进样前，我们必须有把握所选择的检测器能检测到所有的被测样品组分。通常首选可变波长紫外(UV)检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多数样品。UV光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化学结构估算，直接测得（如果可拿到化合物纯品）或在HPLC分离期间用二极管阵列检测器（PDA）得到。样品对UV检测响应不足时，可考虑使用其它类型检测器(荧光，电化学等)，或

6、衍生化样品使检测信号增强。四. 建立分离方法1. 选择HPLC分离模式与起始条件首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定HPLC分离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。而样品特殊需用特殊的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。一般样品可进一步分为中性或离子样品。离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类(电离的强酸或强碱)。如样品为中性，一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱酸性”的反相色谱柱，流动相中加

7、人胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。样品的性质HPLC        GC         CE         SEC        TLC一般样品                 特殊样品中性的          离子的         无机离子异构体                              对映体生物样品等  度                    肽 类糖 类梯  度                 大分子蛋白质离子对                    核  酸糖  类

8、正  相                  合成聚合物图1. 利用样品的有关条件，选择初始实验分离条件  表2  特殊样品的处理样品要求无机离子检测为主要问题；使用离子色谱异构体有些异构体能用