卵巢癌药物敏感基因治疗实验研究——(ⅰ)体外实验

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1、卵巢癌药物敏感基因治疗实验研究——(Ⅰ)体外实验肿瘤1999年第3期第19卷医疗研究作者：徐丛剑　张惜阴　许秀兰　金志军　丰有吉　姚　明　顾　峻　曹斌融　顾健人单位：徐丛剑　张惜阴　丰有吉　曹斌融(上海医科大学妇产科医院(上海200011)；许秀兰　姚　明　顾　峻　顾健人(上海市肿瘤研究所)；金志军(第二军医大学长征医院妇产科)关键词：卵巢肿瘤；细胞，培养的；基因治疗；逆转录病毒载体；单纯疱疹病毒；胸腺嘧啶核苷激酶基因；羟甲基无环鸟苷　　为探索Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因/羟甲基无环鸟苷(HSV1-tk/GCV)药物敏

2、感基因治疗系统应用于卵巢癌，本文进行了一系列实验研究，这里先介绍体外实验结果。　　材料与方法　　1.卵巢上皮癌细胞系AO来自中国科学院上海细胞库；病毒生产细胞(VPC)由上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室顾健人院士提供，包括：(1)VPC/x：可产生不含目的基因的逆转录病毒(RV)；(2)VPC/HSV1-tkc:可产生带有HVS1-tkc的RV颗粒(HSV1-tkc系由HSV1中国株扩增而获得的HSV1-tk基因)。两种RV中均带有新霉素抗性(NeoR)基因。　　2.以RV介导的方法向AO细胞内导入HSV1-tk

3、c，以400μg/mlG418(Sigma)筛选阳性克隆，并以PCR、Southernblot、Northernblot及羟甲基无环鸟苷(GCV)克隆杀伤试验鉴定基因转导，并证实AO细胞内HSV1-tkc为阴性。所用扩增引物为上游：5’AACTGGCGTGAAACTCCCGCACC3’，下游：5’GAGGTATTGTCTCCTTCCGAGTT3’；HSV1-tkc探针为HSV1-tkc完整cDNA，全长1.25kb，由pSKtkc重组质粒DNA经EcoRⅠ和XholⅠ酶切获得；GCV由RochSyntex公司惠赠。　　3.测定

4、GCV、ACV(无环鸟苷)杀伤AO/HSV1-tkc细胞的半数抑制浓度IC50，并以光镜及电镜观察细胞形态及集落形成；以FACS检测细胞周期及DNA倍体分析；以PI(碘化丙锭)染色观察细胞核形态变化。　　4.以含RV的细胞培养液重复感染卵巢癌细胞2～8次，分别计数克隆或给予GCV，观察重复感染是否能提高RV的感染效率。并以HSV1-tkc+的卵巢癌细胞及VPC与HSV1-tkc-的卵巢癌细胞AO混合培养，并对分离培养及混合培养的细胞分别给予GCV(10μg/ml)，观察“旁观者”效应及重复感染对系统作用的影响。　　结　　果　　

5、1.基因转导及阳性克隆筛选、鉴定　VPC/HSV1-tkc培养液对AO细胞的感染滴度为9.3×105集落形成单位(cfu)/ml。感染复数(MOI)为4.6。　　PCR产物凝胶电泳结果显示，AO及AO/x基因组DNA的HSV1-tkc扩增均呈阴性，而AO/HSV1-tkc，VPC/HSV1-tkc组DNA及pSKtkcDNA均显示长度约1.25kb的阳性条带，且此条带Southern杂交也呈阳性。而上述HSV1-tkc扩增呈阳性的细胞，所提取的mRNA作Northern杂交，其结果也呈阳性。　　GCV杀伤AO/HSV1-tkc

6、克隆　1号孔细胞于G-418筛选18天后全部死亡；2，3号孔阳性克隆数分别为46个和52个；2号孔在以后的培养中克隆发生融合，细胞呈复层生长；3号孔在加用GCV后第5天仅剩2个克隆尚有细胞存活，其中一个于第8天死亡脱落，另一个克隆则于第15天细胞全部死亡。　　2.GCV、ACV对AO系列细胞的体外生长抑制作用　GCV，ACV对各细胞的半数抑制浓度IC50值见表1。表1　GCV、ACV对AO系列细胞的生长抑制作用(IC50，μg)　AOAO/xAO/HSV1-tkcGCV1.5851.4310.010ACV58.43　54.72

7、　　3.09　　　电镜下，未经GCV作用的AO/HSV1-tkc细胞与AO细胞形态相似，而经GCV作用后AO/HSV1-tkc细胞则有明显改变，其中，贴壁的细胞核内均一淡染，也可见核仁固缩之细胞，胞浆变化不明显；而已悬浮的细胞核呈棉絮状，胞浆内细胞器明显肿胀。多数细胞核膜及细胞膜尚完整。少数细胞核膜及细胞膜消失，未找到明确的凋亡小体。　　DNA荧光染色　在GCV作用下，AO/HSV1-tkc细胞有部分呈凋亡形态表现，在GCV1μg/ml组中占6.2%，GCV10μg/ml组中占11.3%；而在对照组中仅占1.8%(分别计数10

8、00个细胞)。A0峰细胞比例分析：图1　A0峰细胞比例分析　　图1显示各组细胞中A0峰细胞比例，可见GCV杀伤AO/HSV1-tkc细胞存在明确的剂量依赖性和时间依赖性。　　细胞周期分析　结果显示，GCV作用后各期细胞比例均有明显改变；尤以10μg/mlGCV作用3～4天最为