动物营养代谢病第七章营养代谢病检测技术

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1、营养代谢病检测技术第七章本章目的：本章要求了解营养代谢病检测技术的基本知识。本章重点：１、血糖、蛋白质和脂肪代谢及微量元素测定。２、消化吸收代谢过程本章难点：维生素测定。第一节　蛋白质检测第二节　血糖检测第三节　脂肪代谢的检测第四节　微量元素检测第五节　维生素营养的检测主要内容一、血清总蛋白测定二、血清白蛋白测定三、血清蛋白电泳四、血红蛋白测定五、肌红蛋白测定第一节　蛋白质检测（Ketosisindairycows）一、血清总蛋白测定原理：碱性溶液中蛋白质分子的肽键与铜离子作用，形成紫红色的复合物。这与两个尿素分子缩合生成缩二脲，在碱性条件下与铜离子作用形成紫红色反应相

2、似，故称为双缩脲反应。一、血清总蛋白测定试剂：6mol/L氢氧化钠溶液：溶解120g氢氧化钠于去离子水中，稀释至500ml，置聚乙烯瓶内盖紧保存。双缩脲试剂：称3gCuSO4•5H2O和9g酒石酸钾钠（KNaC4H4O4•4H2O），先分别溶于蒸馏水，加入碘化钾5g，待完全溶解后混合，加入6mol/L氢氧化钠100ml，最后以蒸馏水加至1L置聚乙烯瓶内盖紧贮存。蛋白标准液：收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白质含量，亦可用定值参考血清或标准蛋白作标准。一、血清总蛋白测定操作：取三支试管按下表加入式样，混匀37摄氏度水浴放置十分钟，以空白管调零，540nm波长测定吸光度。项

3、目测定管标准管空白管血清/ml1.00－－蛋白质标准液/ml－1.00－理生盐水/ml－－1.00双缩脲试剂/ml5.005.005.00二、血清白蛋白测定原理：在pH=4.2环境中，带正电荷的白蛋白（pI=4.9）可以与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，溶液由黄变蓝，在波长630nm具有最大光吸收，并与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。二、血清白蛋白测定试剂：溴甲酚绿（BCG）试剂：于1L容量瓶中盛蒸镏水约400ml，加琥珀酸缓冲贮存液100ml，用吸管准确吸取BCG贮存液8ml加入，并将内壁沾的染料冲洗入液体中，加叠氮钠存液2.5

4、ml，聚氧化乙烯月桂醚贮存液2.5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度，配好的BCG试剂pH应为4.15±0.05。白蛋白标准液：40g/L，也可用定值参考血清。均需置冰箱保存。二、血清白蛋白测定操作：血清白蛋白（g/L）=(Odu/Ods)×标准白蛋白浓度（g/L）同时测定血清总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，可得血清球蛋白浓度，并可计算血清白蛋白/球蛋白比值。三、血清蛋白电泳电泳：带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。应用1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2.分析某种物质的纯度及分子量电泳的基本原理电场中推动带电质点运动的力（F）等

5、于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点前移受阻力（F）影响，球形质点服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r半径，η介质粘度，ν质点移速）质点在电场中稳定运动时：F＝F′即：QE＝6πrην同电泳条件下不同物质因其分子大小（r）和带电量（Q）差异而有不同泳动速度，因此，一定时间可分离。按其泳动速度从正极端起〔即速度最快）依次为白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等条带，有的动物α-球蛋白和β-球蛋白可分为两个条带。血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有

6、差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性实验操作及注意事项膜的预处理：将薄膜切成2.5×8cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。加样：光面用

7、铅笔标注，无光泽面距一端1.5cm处用点样器蘸取新鲜血清点样（不能看见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样器。电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，不能留有气泡，平衡5分钟，通电1h。染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。定量：取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4NNaOH4ml；剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺