秋茄实验方法与步骤

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1、胁迫前将秋茄苗（半年）从花盆中取出，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水和超纯水清洗，用滤纸擦干后放入装有4L胁迫液（浓度分别为0，0.2；1；10；50ppm的Hg2+）的桶中胁迫5天，每桶5-10株幼苗。每处理重复三次，共计15盆，约150棵幼苗。测定指标：一、幼苗叶片中Hg的分级二、植物体内汞形态分析三、叶绿素含量的测定四、抗氧化酶的测定五、丙二醛含量的测定六、植物络合素的测定（GSH和NPT）具体方法步骤如下：一、幼苗叶片中Hg的分级将叶片清洗干净后（自来水+蒸馏水+超纯水），取1g叶片去除叶脉，在-3.5Kpa的压力下，用3ml

2、pH6.5的50mMMES-Tris缓冲液真空抽滤渗透2次，滤液至于锥形瓶中,中间放气1次（大于2min），然后在85ml?美国进口的离心管（15ml离心管）中4000g，4度下离心15min，得到上清液即质外体汁液，将上清液转移至试管（依据量的多少看定容到多大容量瓶）中测定汞含量。将残叶于-20度冰箱冷冻2天，自然解冻后，于15ml离心管中4000g，4度下离心15min，然后用乙醇洗涤残叶离心收集汁液，重复2次，合并3次获得的汁液为共质体组分，最后残渣部分为细胞壁。细胞壁成分用硝酸消解后测定汞含量（pH6.5的50mMMES-T

3、ris缓冲液的配置：MES=2-(N-吗啡啉）乙磺酸；Tris=三羟甲基氨基甲烷；用NaOH调节pH至6.5，PH计)二、植物体内汞形态分析参照许嘉琳等的方法，作物体内重金属形态分析采用新鲜样品,以避免在放置过程中重金属的形态发生变化.样品采集后立即洗净,剪成1-2mm2细块,并开始采用逐步分离法,分别提取根、叶中的重金属.主要操作方法如下:对植物体内不同形态重金属进行逐步提取。提取剂及顺序依次为：(1)80％乙醇：提取以硝酸盐，氯化物为主的无机盐以及氨基酸盐等。(2)去离子水：提取水溶性有机酸盐，重金属的一代磷酸盐等。(3)1mo

4、l/L氯化钠溶液：提取果胶酸盐，与蛋白质结合或呈吸着态的重金属等。(4)2％醋酸：提取难溶于水的重金属磷酸盐，包括二代磷酸盐，正磷酸盐等。(5)0.6mol/L盐酸：提取草酸盐等。提取方法：准确称取2.00g鲜样置于烧杯中，加入20mL提取剂，使样品保持浸透状态，并在30℃恒温箱内放置18h后回收提取液。再在放置样品的烧杯中加入同样体积的同样提取剂,浸取2h后再回收提取液，并连续再重复提取2次，即在24h内共进行4次提取。集4次提取液于烧杯中测定其汞含量。每换不同的提取剂前用80%的乙醇清洗烧杯和残叶三遍，用镊子小心将残叶夹在滤纸上

5、，待液体几乎吸收完全后，再加入下一步提取剂。这样重复进行。最终将置于烧杯中最后残叶硝酸消解残渣测定汞含量。三、叶绿素含量的测定混合液的配置：用纯丙酮、无水乙醇和蒸馏水按4.5:4.5:1的比例配成混合液备用。叶绿素浸提：选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀，称取约0.15g叶片放入15mL离心管中，加入10mL混合备用液，振荡后避光保存。当观察到叶片组织变白时，进行光密度测定。叶绿素含量测定：取3mL叶绿素叶绿素浸提液，盛入10mm比色皿中，用混合液作对照。用分光光度计测定645nm和663nm的光密度值，根据以下公式计算叶绿素含量：

6、Ca（mg/g）=[12.7×OD663－2.69×OD645]×V÷1000÷WCb（mg/g）=[22.9×OD645－4.86×OD663]×V÷1000÷WCa+b（mg/g）=[8.02×OD663+20.20×OD645(2.3)]×V÷1000÷WV是浸提液的最终体积W是叶片鲜重四、抗氧化酶的测定4.1酶液的提取分别取相对稳定的1g叶片和根尖样品，剪碎，在预冷的研钵中分次加入0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）5ml以及少量的PVP和少量石英砂于冰浴下研磨,转移至15ml离心管中，再用5ml缓冲液清洗研钵中

7、的残余。匀浆在高速冷冻离心机上4℃19000×g离心10min，上清液用于酶系活性测定。（提取的酶液即为10ml）4.2可溶性蛋白含量测定按照李合生等的方法用考马斯亮蓝G-250进行染色，在波长为595nm处进行比色。用牛血清蛋白作为标准蛋白。试剂:标准蛋白质溶液:100μg/mL牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸馏水稀释至100mL即可。考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%（w/v）的磷酸，再用蒸馏水

8、定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。仪器：722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管标准曲线制作表试管号123456蛋白标准溶液/ml00.200.400.600.801.00蒸馏水量/ml1.000.800.