疟疾检验技术教学ppt课件

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1、疟原虫检验技术●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准”仍然是血液显微镜检查●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准实验室技术厚薄血膜的制作血片制作在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。厚血膜用推片的一角，从取血

2、部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使血液沿边缘散开(如图示).正确的推片姿势标准的疟疾厚薄血膜片位置各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片厚薄血膜的标准●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列血片染色两种染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法常用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置

3、吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(纯)250ml甲醇(纯)250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于5个小时稀释吉氏原液●原液需经pH7.0盐酸缓冲液（PBS）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效

4、果.操作1（快染）配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作2(慢染)在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。吉氏染液浓度门诊染色将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用

5、清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。成批血片染色质量好的染色:核呈红色,胞浆呈蓝色如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片染色过程将血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血膜上，染色10min。用清水细缓冲去染液。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。血片制作与染色注意事项●使用前载玻片一定要清洁，不然会影响血片制作和镜检结果．●厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助

6、于提高镜检质量．●固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜●冲洗染液时，不要冲走厚血膜。原虫密度计算估计疟原虫感染程度有三种方法：●半定量计数法检查厚血膜●白细胞原虫密度计数法　检查厚血膜●红细胞感染率计算法　检查薄血膜用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野1~5个

7、虫，记录“＋”4.平均每个视野6~10个虫，记录“++”5.平均每个视野11~100个虫，记录“+++”6.平均每个视野100个虫以上，记录“++++”。半定量计数法白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）白细胞疟原虫密度计数法重要性●用于疟疾研究●用于临床诊断●用于抗疟后疟疾考核●在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500~1000个）。●白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数×患者每微升血的白细胞数÷计数的白细胞数=疟原虫数/μl血。●如果不知患者的白细胞数

8、，则每微升血以8000个白细胞计数(国际标准)。白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）白细胞疟原虫计数法举例●假设计数200WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（原虫数）x800