tgf-β1对糖尿病肾病早期ecm沉积影响实验探究

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1、TGF-β1对糖尿病肾病早期ECM沉积影响实验探究【摘要】目的研究TGF-β1对糖尿病肾病早期ECM沉积的影响。方法制作清洁级雄性SD大鼠DN模型，饲养14周后取肾脏进行HE染色、PAS染色，用免疫组化方法检测FN、IV-C含量及TGF-β1活性，并进行图像分析；同时设立正常对照组。结果①DN组大鼠肾小管TGF-β1高表达，与正常组比较有较明显的区别；②DN组大鼠镜下见肾小球体积增大，部分以基底膜增厚及系膜物质增多为主，部分以毛细血管管腔扩张为主，肾小管上皮细胞水肿，间质少量纤维组织增生伴炎细胞浸润；③DN组大鼠PAS染色肾小球阳性物质含量明显增加，与正常组比较差别有统计学意义，P<0．0

2、5；④DN组肾小球内FN阳性表达高于正常组，差别有统计学意义，P<0．05；⑤DN组肾小管IV-C强阳性表达，与正常组比较差别有统计学意义，P<0．05。结论DN早期肾小球ECM增加主要与FN大量沉积有关，肾小管ECM增加主要与IV-C大量沉积有关。TGF-β1在肾小管区域的高表达是促使IV-C沉积的主要原因，而肾小球FN的增加可能还有TGF-β1以外的促ECM沉积因素的参与。糖尿病肾病(Diabetic12Nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，常常发展为终末期肾功能衰竭。造成DN发生与发展的因素较为复杂，主要分为遗传因素和非遗传因素。遗传因素主要与基因多态性相关

3、；非遗传因素则包括代谢、血流动力学以及相关细胞因子的异常变化等几个方面；其中TGF-β1为复杂细胞因子网络的中心因子。大量研究证实，DN时肾脏功能及结构变化的基础主要是细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度积聚。ECM成分主要有IV型胶原(typeIVcollagen，IV-C)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、透明质酸(hyaluronic，HA)、层黏连蛋白(lamminin，LN)等。本实验主要研究DN时TGF-β1对ECM各成份沉积的影响。1材料与方法1．1实验动物清洁级雄性SD大鼠，230~300g，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物质

4、量合格证号，粤监证字2006A015。饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房。1．2实验药物及仪器设备链脲佐菌素(STZ)，美国SIGMA公司产品；美国ONETOUCH血糖仪及血糖试纸；RabbitAnti-Fibronectin，RabbitAnti-IVcollagen，RabbitAnti-TGFβ1，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒(AR1022)，武汉博士德生物工程有限公司产品；LeicaTB1020切片机，LeicaRM2135脱水机。OLYMPUSCX21显微镜；ACT-2U图像采集系统，V3．0北航图像分析系统。121．3分组与造模实验大鼠随机分为

5、正常对照组及DN模型组。正常对照组大鼠禁食10h后，称体重并尾部针刺取血测定基础血糖，单次腹腔注射0．1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。DN模型组大鼠禁食10h后，称体重并尾部针刺取血测定基础血糖，按2%STZ溶液55mg/kg体重单次腹腔注射。注射完毕后所有大鼠给予自由饮食、饮水。至第7周，造模大鼠非空腹血糖≥16mmol/L，尿蛋白稳定高于500mg/L者，可临床诊断DN。两组大鼠控制食物量25g/只/d，自由饮水。14周后实验结束，取大鼠肾脏进行检查。1．4肾脏病理学检查固定于10%福尔马林固定液中的肾组织，经常规脱水、包埋、切片后，进行HE染色、PAS染色。1．5肾组织免疫组化染

6、色固定于10%福尔马林液中的肾组织常规脱水、包埋、切片后用免疫组化方法检测FN、IV-C含量。固定于4%多聚甲醛固定液中的肾脏标本，于60min内开始脱水，经常规包埋、切片后，脱腊至水，免疫组化方法检测TGF-β1。于光学显微镜下观察，棕褐色为阳性色。1．6图像分析1．6．112PAS染色标本在图像分析仪10×20倍显微镜头下，随机寻找5个肾小球，测定毛细血管丛相切矩形的面积(S1)，及PAS阳性物质的面积(S2)。计算毛细血管丛面积中PAS阳性物质面积的百分含量(S2/S1)。计算各大鼠肾组织中的5个肾小球内PAS阳性物质所占百分含量的平均值。1．6．2FN免疫组化染色标本在图像分析仪1

7、0×20倍显微镜头下，随机寻找5个肾小球，测定毛细血管丛相切矩形的面积(S3)，及肾小球内阳性颗粒面积(S4)。计算毛细血管丛面积中阳性颗粒面积的百分含量(S4/S3)。计算各大鼠肾组织中的5个肾小球内FN阳性颗粒所占百分含量的平均值。1．6．3IV-C免疫组化染色标本在图像分析仪10×20倍显微镜头下，随机寻找5个含阳性肾小管的视野(S5)，测定该视野内阳性颗粒面积(S6)。计算各视野中阳性颗粒面积的百分含量(S6/S