基因组dna的提取及实验方法

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1、一:基因组DNA的提取采用SDS法,具体步骤如下:①称取2-4克(油菜)叶片,放入研钵中,加液氮后充分研磨。②转入20ml(约样品的一倍体积)DNA提取液中,混匀,65℃水浴振荡(301-501rpm)1h左右。③取出冷却至室温,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液,充分混匀后,置摇床上轻摇一小时。④室温振荡1h左右使之完全混合。⑤室温3000rpm离心30min。⑥取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃静置1h后,使DNA沉淀。⑦钩出DNA,于70%酒精中漂洗2-3次。⑧挑出DNA,用DNA真空干燥机真空干燥后,溶于适量TE(pH=8.0)中。DNA纯化:加入适量10

2、mg/mlRNase,置37oC30min,充分降解RNA。再用氯仿-异戊醇抽提一次,DNA沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量DNA稀释液与标准浓度λDNA同时在1%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA定量并检查DNA质量。附:(1)DNA提取液(1000ml)1MTris-HCl(PH8.0)100ml0.5MEDTANa2(PH8.0)100ml5MNaCl100ml20%SDS62mlNaBisufite(CodaS-9000)sigma)3.8gddH2O637.5ml即配即用,充分混匀后调节pH至8.0。(2)50×TE(100ml)Tris-HCl242g冰醋酸57.1mlEDT

3、ANa218.6g加水至1000ml,灭菌。(3)Tris-HClpH=8.01M1000mlTris碱14.1gH2O800ml浓HCl49ml混匀充分溶解后,调整pH至8.0,灭菌。PCR反应在10ml体系中进行模板(基因组DNA)1ml(10ng/ml)Primer(R)0.2ml(10uM)Primer(F)0.2ml(10uM)10×buffer1mldNTP(2.5mM)0.8mlMgCl2(25mM)0.8mlTaq酶0.1ml(0.5U)ddH2OH2O5.9ml10mlPCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2ml,混匀,取4mlPCR扩增产物用1%琼

4、脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V,电泳1h左右,UV检测扩增产物的多态性。PCR扩增条件94℃3min94℃35cycles30SecX(按所用引物确定退火温度)50Sec72℃1min72℃10min4℃保存二:种子贮藏蛋白质样品的提取按Hurkman和Tanaka(1986)的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法,并有所改进。将0.5g成熟种子在液氮中研磨成粉末状,分别加入提取液10mL[50%(v/v)苯酚,0.45M蔗糖,5mMEDTANa2,0.2%(v/v)β-巯基乙醇,50mMTris-HCl,pH8.8],充分混匀后将装有匀浆液的离心管在4℃条件下,摇床上振

5、荡30min,然后4℃5000g离心15min,吸取上清液至新一离心管中加入5倍体积的-20℃的0.1M乙酸铵(0.7708g乙酸铵溶解在无水的100mL甲醇中),-20℃冰箱静置沉淀16h或过夜。第二天4℃5000g离心10min,沉淀的蛋白用0.1M乙酸铵洗涤2次,再用冰冻的80%的丙酮洗1次,最后用70%的乙醇洗涤后,蛋白粉37℃干燥后,放置-70℃冰箱保存备用。(接下来要做SDS-PAGE跑垂直胶)SDS-PAGE电泳按Sambrook等(1989)的SDS-PAGE程序,取适量种子总蛋白样品与2×样品缓冲液(100mmol/LTris-HCl,pH6.8,200mmol

6、/LDTT,4%SDS,20%Glycerol,0.2%bromophenolblueR)混合,99℃变性处理10min后,在8%的分离胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。使用DYY212型电泳仪和DYCZ228C型垂直双板夹芯式电泳槽,电极缓冲液为十二烷基硫酸钠-甘氨酸(pH8.3)。每个样品点样15µl,室温下40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界面时,再调至100V稳压电泳,待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。染色和脱色取下胶后,在染色液(1.0g考马斯亮蓝R250,450mL甲醇,100mL冰醋酸,450mL双蒸水)中染色30min,然后用脱色液(100mL甲醇

7、,100mL冰醋酸,800mL双蒸水)脱色1d。Rf值及统计蛋白质亚基条带数参照刘敏轩等(2006)的方法,根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的Rf值及统计蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率Rf=蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。记录样品中产生的多态性蛋白带,同一Rf值位置上有蛋白条带的记为1,无蛋白带记为0。输入计算机,用cluster软件统计分析,根据Main方法构建表征树。三:叶片全蛋白的提取——三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法取油菜叶片3-4g放入预冷的研钵中加入液氮研磨成

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