聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋白

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳实训步骤一、实训原理：聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子的大小，形状的不同，在电场的作用下，产生不同的速度而分离的方法。它具有分子筛效应、电荷效应、浓缩效应三重作用。在这三重效应的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白质分离开来二、实训器材与试剂（一）器材电泳仪电泳槽注射器长针头吸管培养皿（二）试剂1.三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）2.贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。3.染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸

2、溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。4.脱色液：7%醋酸溶液。5.电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.6.示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液四、操作步骤：1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界

3、面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7，浓缩胶）：将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。然后胶管于烘箱中25℃~35℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。2.安装胶管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽

4、注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。3.加样0.5ml新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释。用微量注射器或移液枪向胶管内加20ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。4.电泳上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。5.剥胶取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水

5、，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离6.染色及洗脱1).将取下的胶条放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考马斯亮蓝水溶液染色15min，7%醋酸过夜保存。2).将取下的胶条放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡过夜。注:染液回收。7.观察绘图将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上五、注意事项：1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2．制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。3．注意观察

6、实验现象：分界面，浓缩效应.4.染液回收。5．固体胶切忌倒入水池。