发酵工程实验讲义2010129

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1、发酵工程实给讲义----10升发酵罐的分批发酵［实验目的］通过本实验加深对发酵罐结构原理和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本工艺和方法并掌据相关发酵参数的测定方法。［实验原理］一、分批发酵原理分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。它的一个显著特点是培养基一次性加入，产品一次性收获，分批发酵是目前广泛采用的一种发酵方式。分批发酵过程一般可以粗分为四期：停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。停滞期，即刚接种后的一段时间，细胞数目和菌量不变，因菌对新

2、的生长环境又一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。当细菌已经适应新的环境，养料充足而又无抑制生长的物质，便进入对数生长期，其比生长速率达到最大。随着养料的减少，有害代谢产物的积累，生长不可能再无限制地继续。此时比生长速率为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐退化，经短时间的减速后进入稳定期，此时净生长速率为零。当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期，此时生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时结束培养。9发酵工程

3、实给讲义（图例）微生物四个时期的生长曲线其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐

4、、加料、灭菌等时间。二、发酵罐结构原理（工作原理）发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。其工艺流程图如图一。［材料与设备］一、发酵菌种：枯草芽孢杆菌-91422荧光假单胞菌-dgkw大肠杆菌（含pVAX1）9发酵工程实给讲义一、培养基1．种子培养基——LB固体/液体培养基（略）2．发酵培养基枯草芽孢杆菌：糖蜜10g/L，鱼粉10g/L，Nacl2.5g/L，CaCl21g/L，MgSO4·7H2O1.25g/L，KH2PO4为0.38g/L，麦麸为5.20g/L，玉米粉为6.49g

5、/L。荧光假单胞菌：糖蜜6.73g/L，麦麸13.09g/L，KH2PO40.53g/L,米糠10g/L,Nacl2g/L,MgSO41/L。大肠杆菌：糖蜜=4.5g/L玉米浆=8.5g/L工业蛋白胨=8.5g/LK2HPO4=2.3g/LKH2PO4=1.5g/L甘油=10ml/LMgSO4.7H2O=0.25g/L二、相关试剂（1）3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制将1.0g3,5-二硝基水杨酸溶于13.33mL2NNaOH溶液中（不适宜用高温促溶，可以50—60℃溶解），接着加入100mL含26g酒石酸钾钠的溶液，混匀

6、。再加入1g结晶酚和1g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至200mL。暗处保存备用（用棕色瓶装）。（2）碘液:5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。（3）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%（V/V）的乙醇中。（4）HCl溶液（6N）用配好的取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。（5）NaOH溶液（6N）用配好的取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。（6）无氨水：可用一般纯水通过强酸性阳离子交换树脂或加硫酸和高锰酸钾后，重蒸馏得到。（7）25%的NaOH溶液。（8）10%硫酸锌溶液。（9）纳氏试

7、剂：称取16g氢氧化钠，溶于50mL水中，充分冷却至室温。另称取7g碘化钾和碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中。用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存。9发酵工程实给讲义（10）酒石酸钾钠溶液：称取50g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)溶于100mL水中，加热煮沸以除去氨，放冷，定容至100mL。一、仪器设备双联自动机械搅拌不锈钢发酵罐、空气压缩机、蒸汽发生器、PLC控制柜、电脑、紫外分光光度计、恒温生化培养箱、恒温振荡培养箱、数显恒温水浴箱、超净工作台、电磁炉等。［实验步骤］一

8、、菌种的制备取冷冻甘油种接种到LB琼脂板中，在琼脂板中挑取单菌落接到试管斜面。取斜面种接种于装有50ml/瓶液体LB培养基的500ml三角瓶中，220rpm,30oC摇床振荡培养过夜（约16h）。根据接种量5%确定种子液为200ml,发酵前准备种子