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《sirna特异性“沉默”bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、siRNA特异性“沉默”Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响安徽医科大学ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2007Dec;42(6)?595?◇基础医学研究◇siRNA特异性"沉默"Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响江蓓蕾,叶艳,程文晋,陈思,吴萍,张旭东,张林杰摘要目的研究BID-only蛋白Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用.方法流式细胞仪PI单染法检测细胞凋亡率;JC.1染色检测线粒体膜电位的变化;在紫杉醇相对敏感SGC-7901胃腺癌细胞株中采用小干扰RNA(siR
2、NA)技术特异性"沉默"Bim基因;Westernblot分别检测紫杉醇诱导siRNA"沉默"Bim基因前后Bim蛋白的表达水平变化.结果紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性,SGC-7901较BGC-823胃腺癌细胞株对紫杉醇更为敏感.紫杉醇诱导SGC-7901及BGC-823胃腺癌细胞很大程度依赖线粒体途径凋亡.特异性"沉默"Bim基因的转录,紫杉醇诱导凋亡敏感细胞株SGC-7901的凋亡率明显降低.结论Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥关键调节作用.主题词胃肿瘤;细胞凋亡;紫杉醇;siR
3、NA;RNA;小分子干扰自由词Bim中图分类号R735.2;R329.2;R282.71;R342.2文献标识码A文章编号1000—1492(2007)o6—0595—04Bim(Bcl-2interactingmediatorofcelldeath)是BH3.only蛋白家族中促凋亡成员,也是线粒体凋亡途径上游重要的凋亡调节蛋白¨I2J.目前研究认为抗微管化疗药物治疗实体肿瘤可通过上调Bim活性,诱发细胞凋亡,从而降低肿瘤的发展I4J.本课题组在前期研究中发现,Bim蛋白在紫杉醇诱导的胃腺癌细胞凋亡中表
4、达增高,同时Bim移位于线粒体膜呈高表达J.本研究在前期研究的基础上,采用Bim的小分子干扰RNA(siRNA)特异性下调Bim蛋白的表达,同时联合抗微管化疗药物紫杉醇处理,以进一步探讨Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡的作用.1材料与方法1.1细胞培养及药物处理SGC-7901及BGC一823200r7一l1—15接收基金项目:国家自然科学基金(编号:30572118),安徽省自然科学基金(编号:070413077)作者单位:安徽医科大学免疫学教研室,合肥230032作者简介:江蓓蕾,女,硕士研究生;张林
5、杰,男,教授,硕士生导师,责任作者,E—mail:z33@ahlnu.edu.ell胃腺癌细胞系(购自中科院上海细胞库)在含10%小牛血清,1%双抗,1%L一谷胺酰胺的高糖DMEM培养基(Gibco公司),37℃,5%CO2,饱和湿度下培养.紫杉醇(美国百时美施贵宝公司)用细胞培养液配置0.3~mol/L贮存液一20℃保存,使用前稀释成工作浓度.细胞传代后24h,PBS洗涤2次,对照组更换新鲜培养液,药物组加入所需要不同浓度紫杉醇诱导,并按所需要的不同时间收集备用.1.2PI单染流式细胞仪检测凋亡率将对数
6、生长期的SGC-7901及BGC一823胃腺癌细胞接种于24孔板培养过夜,不同时间加入不同浓度的紫杉醇处理,均设立阴性对照.分别收集24孔板中不同浓度及各时间点的上清液,各孔再用PBS洗涤1遍,低速离心弃上清,每孔加750的PI(Biosharp)染液,37℃避光,10～20min完全消化后收集,4℃避光过夜.上流式细胞仪(FASCalibur)检测.每组实验重复3次.资料用WinMDI2.8软件分析,PI阳性细胞百分率即细胞凋亡率.绘制量效及时效曲线.1.3JC-1染色检测线粒体膜电位变化将对数生长期的
7、SGC.7901及BGC一823胃腺癌细胞接种于24孔板培养过夜,以0.3~mol/L紫杉醇分别诱导8,24,48h,设立阴性对照.胰酶消化法收集各孔细胞于流式管中,PBS洗涤离心,jc.1染色(终浓度为10mg/L,MolecularProbes,Eugene,OR),37℃避光,15min,弃染液,PBS重悬,流式细胞仪检测.在线粒体膜电位较高时,JC一1聚集在线粒体的基质(ma—trix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光,即右上1/4象限;在线粒体膜电位较低时,JC一1不
8、能聚集在线粒体的基质中,JC一1为单体(mono—mer),可以产生绿色荧光,即右下1/4象限;每组实验重复3次,资料用WinMDI2.8软件分析.1.4siRNA技术"沉默"Bim基因的表达将对数生长期的SGC.7901及BGC一823胃腺癌细胞,调整细胞密度为4×10和1×10分别接种于6,24孔板.用含10%小牛血清无抗生素HyQDMEM(海克隆生物化学制品北京有限公司)培养24h,转染前弃原液换成含5%小牛血清无抗生素
