植物生物学实验(植物生理)教案

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1、实验一多酚氧化酶活性测定（3学时）一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。三、器材与试剂低温离心机、s22pc分光光度计、儿茶酚、pH7.2磷酸缓冲液四、实验内容：1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mLpH7.2磷酸缓冲液，少许PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mLpH7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃4000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。2．在试管中，加入2.5mLpH7.2磷酸缓冲

2、液，1.5mL儿茶酚以及1mL粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。4．计算酶活力。按下式计算PPO活性＝U/mingFWA值增加0.001定义为一个酶活力单位。五、实验报告：计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数值求平均值。实验二植物耐盐生理指标测定（9学时）一、实验目的：1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制2、了解植物盐处理的方法3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法5、掌握丙二醛含量的测定方法6、掌握基本的数据统计方

3、法二、实验原理    植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势,维持植物体内的水分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下

4、，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物

5、遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。三、实验主要仪器和试剂仪器:离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。（二）盐胁迫处理6用200mmol/LNaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处

6、理分别重复3次。（三）脯氨酸含量测定1.标准曲线的制作用100μg/ml脯氨酸配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3%磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。2.脯氨酸的提取称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，4000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。3.反应体系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸

7、，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。4.脯氨酸的含量的计算从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。（四）过氧化物酶活性的测定1.过氧化物酶的提取称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加5mlpH6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02gPVP-30（除