elisa试剂影响因素和常见问题分析

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1、ELISA试剂影响因素和常见问题分析1.标本及采集、运输因素12.试剂的影响23.操作技术的影响34.显色和比色55.HOOK效应影响56.干扰物质的影响57.药物的影响68.抗原自身因素69.异常结果分析79.1白板79.2显色弱、灵敏度低79.3灵敏度过高、板底高、背景高89.4假阳性89.5重复性差9由于ELISA（酶联免疫实验）具有灵敏度高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、艾滋病、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一

2、定的认识。优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就容易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。1.标本及采集、运输因素严重溶血，以HRP为标记的ELISA测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶催化活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或

3、附着在聚乙烯内不易洗净；如有细菌污染，军体内可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不干净、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般来说，在5天内测定的血清标本可放置在4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。超

4、过一周测定的标本需要在-20℃保存。冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分布不匀，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清应先离心或过滤，澄清后在检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冷冻；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶的活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时带分离胶的采血管或于采血管中加入适当

5、的促凝剂。2.试剂的影响ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过度。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA试剂盒来说，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅仅包括

6、了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。稳定性好。包被的抗原稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被原料的试剂盒效期只有3-4个月，采用基

7、因工程抗原后，效期大大延长了。基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的敏感度，提高检出率。纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有一下特点：Ø分子量小；Ø一般只含有一个抗原决定簇；Ø纯度高；Ø稳定性差；国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度和差异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板空间A值差

8、大于15%；标记酶的活性及显色的稳定性比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时