细胞工程原理与技术-实验计划

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1、《细胞工程原理与技术》实验计划实验班级：07级指导老师：魏海明　吕新怀　郑晓东张晓龙金晶实验室负责人：吕新怀xhlv@mail.ustc.edu.cn,3600453实验1　HL-60细胞的培养、传代、复苏和冻存1、HL-60细胞的培养与传代（第一周）1.1　实验分组　　83_人分3大组进入万级净化细胞间，每大组27，27，29人，分9个小组，每小组3人，实验材料准备及实验操作以小组为单位。1.2　实验材料　　HL-60细胞，无菌完全RPMI-1640培养液，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养

2、箱等。1.3　实验方法HL-60细胞为悬浮细胞生长的细胞，可在完全RPMI-1640培养液中培养，该培养液由90％不完全1640培养液[RPMI-1640液95毫升；0.1M丙酮酸钠1毫升；0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　1毫升；1M　Hepes1毫升；7.5％NaHCO３　1毫升；青霉素、链霉素(各1万单位)1毫升]和10％灭活胎牛或新生牛血清。传代时不必采用酶消化法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。通常采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一起转移到离心管内，离心800rpm×5min,然后去除上清，加新的培养液到离心管内

3、，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。根据细胞数量，可采用1瓶传3瓶或其它比例传代。2HL-60细胞的冻存（第一周）2.1原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。为了避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞

4、应该特性化并检查是否污染。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。2.2试剂和器材2.2.1器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管）、离心管、吸管、离心机等。2.2.2试剂：0.25％胰酶、RPMI-1640培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）。2.2.3冻存液配制培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：*包含10％甘油的完全培养基，*包含10％二

5、甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，*50％细胞条件培养基和50％含有10％甘油的新鲜培养基，或*50％细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：　*50％细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜无血清培养基或*包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。2.3方法与步骤2.3.1消化细胞（贴壁细胞），将细胞悬液收集至离心管中。2.3.21000rpm离心10分钟，弃上清液。2.3.3沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左

6、右。2.3.4将悬液分至冻存管中，每管1ml。2.3.5将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。2.3.6贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。2.3.7按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。2.4注意事项操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。3冻存细胞的复苏（第二周）冻存细胞比较脆弱，

7、要求轻柔的操作。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基中。如果细胞对冻存剂（DMSO或甘油）特别敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。3.1取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。3.2把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。3.3以大约800rpm离心2到3分钟，弃去上清。3.4在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞

8、计数。3.5细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。实验2流式细胞仪原理及细胞凋亡分析（第二周）流式细胞仪（flowcytometry），又叫荧光激活细胞分选器（FACS），多数流式只是个零分辨率的仪器，也就