实验二十 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶

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1、实验二十赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 【原理】利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，．求出样品中ALT活性。【试剂】1.0.lmol／L磷酸二氢钾溶液称取KH2P0413.61g，溶解于蒸馏水中，加水至1000ml，4℃保存。2.0.lmol／L磷酸氢二钠溶液称取Na2HP0414.22g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml，4℃保存。3.0.lmol／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)取420ml0.1mol／L磷酸氨二钠溶液和80ml0.lmol／L磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7．4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴

2、，4℃保存。4.基质缓冲液精确称取D-L-丙氨酸1．79g，α-酮戊二酸29.2mg，先溶于0.lmol／L磷酸盐缓冲液约50ml中，用lmol／LNaOH调pH至7．4，再加磷酸盐缓冲液至lOOml，4～6℃保存，该溶液可稳定2周。每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g或加氯仿防腐，4℃保存。配成200mmol／L丙氨酸与2.0mmol／Lα-酮戊二酸基质缓冲液。5.1.0mmol／L2,4-硝基苯肼溶液称取2,4-二硝基苯肼(AR)19.8mg，溶于l.0mol／L盐酸100ml，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若有结晶析出，应重新配制。

3、6.0.4mol／LNaOH溶液称取NaOH1.6g溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。7.2.0mmnol／L丙酮酸标准液准确称取丙酮酸钠(AR)22．0mg，置于100ml容量瓶中，加0.05mo1／L硫酸至刻度。丙酮酸不稳定；开封后易变质(聚合)，相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。8．待测标本病人血清或质控血清。【操作步骤】1．ALT校正曲线绘制(1)按表14-7向各管加入相应试剂。(2)混匀，放置5min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“O”号管吸光度为

4、该标准管的吸光度值。(3)以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成校正曲线。2．标本的测定(1)在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37℃水浴预温5min后使用；具体操作按表14-8进行。(2)室温放置5min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在校正曲线上查得ALT的卡门单位。【参考范围】5～25卡门单位。【临床意义】ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。当肝受损时，此酶可释放入血，致血

5、中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断指标。1．肝细胞损伤的灵敏指标急性病毒性肝炎转氨酶阳性率为80％～100％，肝炎恢复期，转氨酶转入正常，但如在100U左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎；重症肝炎或亚急性肝坏死时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时，酶活性反而降低，是肝细胞坏死后增生不良，预后不佳。以上说明，监测转氨酶可以观察病情的发展，并作预后判断。2．慢性活动性肝炎或脂肪肝转氨酶轻度增高(100～200U)，或属正常范围，且AST>ALT。肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。其他原因引起的肝

6、损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高；某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。3．但其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高，如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。【注意事项】1．丙酮酸标准液的配制丙酮酸不稳定，见空气易发生聚合反应，生成多聚丙酮酸，而失去其化学性质。在配制校正曲线时，不会出现显色反应。此时应将变性的丙酮酸放在干燥箱(40～55℃)2～3h，或干燥器中过夜后在使用。2．基质液中的α-酮戊二酸和显色剂2,4

7、-二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，如超出此范围，应检查试剂及仪器等方面问题。3．血清中ALT在室温(25℃)可以保存2d，在4℃冰箱可保存1周，在-25℃可保存1个月。一般血清标本中内源性酮酸含量很少，血清对照管吸光度接近于试剂空白管(以蒸馏水代替血清，其他和对照管同样操作)。所以，成批标本测定时。一般不需要每份标本都作自身血清对照管，以试剂空白管代替即可，但对超过正常值的血清标本应进行复查。严重脂血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和

8、2,4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。4．赖氏法考虑到底物浓度不足，酶作用产生的丙酮酸的量不能与酶活性成正比，故没有制定自身的单位定义