cdna-aflp详细步骤

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1、3.2.3双链cDNA的合成及精制(1).第一链cDNA的合成采用TaKaRa公司一链合成试剂盒进行，具体操作如下：在PCR管中加入下列反应成分：总RNA约5μg，Oligo(dT)18（50μmol/L）1μL，dNTP（10mmol/L）1μL，DEPC-H2O补足10μL。于65℃变性5min，置于冰上2min。向上述PCR管中继续加入下列成分：5×RTBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，M-MμLVReverseTranscriptase（5U/μL）1μL，ddH2O4.5μL，总体积20μL，混匀稍离心，42℃

2、温浴1h，70℃15min使酶失活，直接进行第二链合成。42℃恒温1h，70℃水浴10min，然后置于4℃冷却。然后进入第二链的合成(2).第二链cDNA的合成使用DNApolymeraseⅠ（TaKaRa，大连）和RNaseH（TaKaRa，大连）进行，体系如下:ComponentvolumecDNA第一链10.0μL反应buffer14.0μLdNTP(10mM)1.5μLDNAPolymerseⅠ（4U/μL）3.5μLRNaseH（10U/μL）0.2μLDNA连接酶(350u/μL)0.3μLdd-H2O10.5μLFinalvolume40.0μL轻

3、轻混合，稍离心，PCR仪上16℃反应2.5h，70℃终止反应10min。加入0.4μLT4DNA聚合酶，轻轻混合，PCR仪上37℃反应10min。加入5μL200mmol/LEDTA终止反应。(3).双链cDNA的精制向第二链合成产物中加入50μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液，剧烈混匀，室温12000r/min，离心10min。将上清转入另一离心管中，加入100μL预冷（-20℃）的异丙醇，-20℃放置2h以上。4℃，12000r/min，离心15min，弃上清，沉淀用沉淀用75％的乙醇（4℃放置）洗两次。沉淀风干5-10min，加入10－20μL

4、的ddH2O溶解。用1.5％的琼脂糖快速电泳检测，并测定OD值。-20℃保存备用。413.2.4cDNA-AFLP差异显示3.2.4.1限制性酶切酶切体系参照内切酶说明书进行。(1).TaqⅠ酶切：在PCR管中加入模板cDNA约200ng，10×RLBuffer4μL，TaqⅠ酶（20u/μL）0.5μL，ddH2O补足40μL，混匀，稍离心，65℃反应2h。(2).AseⅠ酶切：在上述管中继续加入以下成分：10×RLBuffer2μL，AseⅠ酶（20u/μL）0.5μL，ddH2O7.5μL，总体积50μL，混匀，稍离心，37℃反应2h。3.2.4.2接头连

5、接向酶切产物中继续加入下列成分：TaqⅠ接头（25pM）2μL，AseⅠ接头（5pM）1μL，ATP(10mM)0.5μL，T4DNALigaseBuffer0.5μL，T4DNALigase(350u/μL)0.2μL，ddH2O0.8μL，总体积55μL，混匀，稍离心，37℃，3h。连接反应结束后于-20℃保存。注：TaqⅠ接头分别由T1和T2等莫尔浓度配制，AseⅠ接头分别由A1和A2等莫尔浓度配制.3.2.4.3预扩增预扩增体系为：ComponentvolumecDNA酶切连接产物5.0μL10×PCRbuffer2.0μLMg2+(25mM)2.0μL

6、dNTP(10mM)0.5μL预扩引物A3（20μM）1.0μL预扩引物T3（20μM）1.0μLTaqDNAPolymerase(5U/μL)0.15μLddH2O8.35μLFinalvolume20μL混匀，稍离心，进行PCR扩增反应。扩增程序为94℃2min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，共25个循环；72℃10min。结果取5μL，用1.0％的琼脂糖检测。3.2.4.4选择性扩增预扩增产物稀释20×后进行选择性扩增，其体系为：42Componentvolume20×稀释的预扩增产物2.0μL10×PCRbuffer2.0μLMg2+(25m

7、M)2.0μLdNTP(10mM)0.5μL选扩引物A（20μM）1.0μL选扩引物T（20μM）1.0μLTaqDNAPolymerase(5U/μL)0.2μLddH2O11.3μLFinalvolume20.0μL混匀，稍离心，进行PCR扩增反应，扩增程序为94℃2min；94℃30s，65℃（每循环降低0.7℃）30s，72℃60s，共12个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min共23个循环；72℃10min。。共用16个A引物和16个T引物，组成256对引物组合对所有材料分别进行cDNA-AFLP差异显示分析。3.2.4.5聚丙烯凝胶电泳分析

8、电泳分析采用20cm×2