论国际贸易中我国知识产权保护现存的问题及对策分析

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1、重组蛋白包含体的复性[摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。[关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成Abstract：ExpressionofrecombinantproteinsinEscherichiacolioftenresultsintheformationofinsolubleinclusionbodies.Activ

2、eproteincanberecoveredbysolubilizationofinclusionbodiesfollowedbyrenaturationofthesolubilizedprotein.Theprocessofrenaturationisestablishedintheunderstandingtothemechanismofproteinfoldinginvitro.Inrecentyears,Withtheunderstandingofmechanismsofproteinfolding,manyrenaturationmethodswere

3、developed,whichcanincreasetheyieldofactiveproteins.Keyword:proteinfolding、inclusionbody、renaturation、theformingofdisulfidebond大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复

4、性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。1.蛋白质的体内折叠细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。

5、近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环

6、境－－真核细胞。蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]8，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有真核细胞中相应的协助蛋白折叠的系统。当通过基因工程手段在大肠杆菌中表达外源蛋白时，额外的代谢负担给宿主细胞带来了压力，许多蛋白就会形成包含体。一般来说，处于还原环境的细菌胞质不能有效的完成二硫键蛋白质的氧化折叠[6]。也有研究表明，重组蛋白包含体的形成与蛋白质的一些主要的理化参数，如电荷平均数，易形成转角的氨基酸的含量，半胱氨酸及脯氨酸的比例，亲水性以及氨基酸总数等有关[7]。2.蛋白质体外折叠的机理1961年，Anfinsen发现，在自由能驱动下，

7、变性后的牛胰核糖核酸酶(RNaseA)可在体外通过空气氧化自发形成正确的二硫键。这个经典的实验揭示了蛋白质一级结构和高级结构的关系，Anfinsen指出：蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部信息，变性的蛋白质在一定的条件下可以完全自发地恢复活性。他还发现，在一个合适的氧化还原的环境下，蛋白质刚开始错搭的二硫键可以被打开并不断地移位，重排形成正确的二硫键[8]。1970年，Taniuchi指出，把124个氨基酸组成的RNaseAC末端的4个氨基酸去除，剩下的蛋白是无法再折叠形成天然的二硫键的，说明了不完整的RNaseA结构域是无法正确折叠。接着在1973年，W

8、etlaufer在进行蛋