细菌的简单染色法和革兰氏染色法

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1、实验一细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求1.学习微生物涂片、染色的基本技术,并掌握革兰氏染色的方法。2.初步认识细菌的形态特征,掌握无菌操作技术。3.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1.简单染色法:用单一染料进行细菌染色,操作简便,适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色,这是因为:在中性、碱性或弱碱性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时,其分子的染色部分带正电荷),因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色,经染色后的细菌细胞

2、与背景形成鲜明的对比,在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。2.革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法(Gramstain)不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏染色阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,

3、由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易着色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basicdye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorisingagent)和复染液(counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色

4、的初染液一般是结晶紫(crystalviolet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌(Escherichiacoli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),枯草芽孢杆

5、菌(Bacillussubtilis),藤黄微球菌(Micrococcusluteus),蜡样芽孢杆菌(B.cereus)12~20h斜面培养物;革兰氏染液,载玻片,显微镜等。四、操作步骤1.涂片取两块载玻片,各滴一小滴蒸馏水于玻片中央,用接种环以无菌操作分别从培养14~16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中,混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹;滴蒸馏水和取菌不宜过多;涂片要均匀,不宜过厚。2.干燥室温自然干燥。3.固定固定时通过火焰2~3次即可。此过程称热固定,其目的是使细胞质凝固,以固定细胞形态,并使之牢固附着

6、在载玻片上。热固定温度不易过高,以载玻片背面不烫手为宜,否则会改变甚至破坏细胞形态。4.染色(1)简单染色法:①染色滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1~2min;石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。②水洗倾去染液,用自来水冲洗,直至涂片上流下的水无色为止。水洗时,不要直接冲洗液面,而应使水从载玻片的一段流下,水流不易过急过大,以免涂片薄膜脱落。③干燥自然干燥或用电吹风吹干,也可用吸水纸吸干。④镜检涂片干燥后镜检。(2)革兰氏染色法:①初染加草酸铵结晶紫一滴,约1~2min,水洗。②媒染滴加碘液冲去残水,并覆盖约1

7、min,水洗。③脱色将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止,约20~30s,立即用水冲净酒精。④复染用番红液染1~2min,水洗。⑤镜检干燥后,置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。(3)混合涂片法:按上述方法,在同一玻片上,以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也

8、影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。实验二细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1.学习并掌握芽

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