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1、光合细菌培养基配方的优化研究摘要:光合细菌培养基的组分是由乙酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏等5种原料构成。采用L16(45)正交表,将5种原料作为光合细菌生长有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化。试验结果表明,当培养基的配方为乙酸钠3.3g/L、氯化铵0.6g/L、磷酸二氢钾0.9g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母膏1.5g/L、光照3000lx和温度(32?2)e时,培养72h即可达到生长峰值,细菌总数可以从起初的1.75@109cfu/mL提高到3.19@109c
2、fu/mL。优化的培养基条件能有效促进光合细菌生长。关键词:光合细菌;标准曲线;平板菌落计数;正交试验设计;培养基优化1试验材料试验菌种:光合细菌(PhotosyntheticBacteria,PSB)由山东省淡水水产研究所分离、提纯、培养而获得,主要菌种为沼泽红假单胞菌。液体培养基基础配方:乙酸钠2.5g,酵母膏2.0g,MgSO40.5g,NH4Cl1.0g,KH2PO40.5g和无菌水1000mL[1]。固体培养基(用于平板菌落计数)配方:牛肉膏1.5g,蛋白胨5.0g,NaCl2.5g,琼脂7.
3、0g和无菌水500mL[1]。主要仪器:生化培养箱LRH)150B,紫外线分光光度计Cary100,自控振荡机ZD,显微镜O-lympusCX41,蒸汽消毒器YXQG02,电子天平AG204,振荡培养箱BS)IEA;无菌吸管,培养皿,试管及试管架、三角烧瓶等常用试验室器皿。主要试剂:乙酸钠,氯化钠,氯化铵,磷酸二氢钾,结晶硫酸镁,碳酸氢钠均为分析纯(AR);蛋白胨,牛肉膏,酵母膏和琼脂均为生化试剂(BR)。2试验方法2.1光合细菌浓度OD660值标准曲线的测定2.1.1基本原理用紫外线分光光度计进行光学
4、密度测定,来获得光合细菌不同标准浓度菌悬液的OD660值[2],绘制光合细菌浓度OD660值的标准曲线。2.1.2操作步骤标记:取11支无菌20mL试管,用记号笔分别标明光合细菌浓度,0.00,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09和0.10。接种:分别用10mL无菌吸管吸取光合细菌菌悬液2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0mL分别放入20mL试管中,加入液体培养基至20mL,并用自控振荡机摇晃均匀。
5、2.1.3OD660值测定结果2007年6月2日,提取不同标准浓度PSB菌悬液、液体培养基作空白;选取波长660.00nm,光束模式为双光束自动选择模式,进行OD660测试,其回归方程为:y=0.50601x(r=0.99907)式中,x为光合细菌浓度;y为OD660值;A为截距;B为斜率。2.2平板菌落计数法试验2.2.1操作步骤取无菌培养皿9套,将光合细菌菌悬液依次稀释至10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。置入自控振荡机上振荡,使菌液充分混匀。用3支1mL无菌吸管分
6、别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各0.1mL,分别放入已做好固体培养基平板的培养皿中,并用玻璃涂棒将菌液涂布均匀。每种稀释浓度3个设置重复,及时放入生化培养箱中,调至(32?2)e,进行光照培养。培养48h后,取出培养平板,对各培养皿中形成的菌落计数,算出同一稀释度3475渔业现代化62007年第34卷第6期个平板上的菌落平均数,并按下列公式进行计算:1mL中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度3次重复的平均菌落数@稀释倍数@10[1]2.2.2试验结果(1)平板菌落计数结果(表1)(2)P
7、SB菌悬液OD660值测试结果(表2)表1培养后菌落计数结果表稀释度10-5123平均10-6123平均10-7123平均cfu数/平板2262181619832020.326728122625831423335.3cfu数/mL2.02@1092.58@1093.53@109注:采集时间为2007-06-0615:10:15;光合细菌(PSB)菌悬液平均浓度=2.71@109个/mL。表2培养时光合细菌(PSB)菌悬液OD660值测试表样品浓度度数值(g/L)浓度平均值(g/L)平均值(Abs)标准偏
8、差SD均方差%RSD读数值(Abs)3个平行样3.13.13.13.11.56360.011740.751101.5501.5661.573注:采样时间为2007-06-0415:18:57。2.3光合细菌生长正交试验2.3.1试验原理光合细菌生长受到多种因素的影响。利用规格化的表格L16(45)正交表,合理安排试验,通过极差、均值统计分析,筛选出光合细菌最佳培养基的配方[3-5]。2.3.2正交试验方案(表3)表3液体培养基L16(45)
