荧光定量pcr问题汇总

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1、荧光定量PCR问题汇总1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合平盖的光学

2、八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　·在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(Mycomputer)

3、。　　·在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　·在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragmentnow)。　　·单击碎片整理(Defragment)。　　·当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。　　·在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。·为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4.何时执行windowsservicepack更新？不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWindows

4、操作系统有可能与SDS软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装servicepack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5.应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDSDocument。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几

5、个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。7.怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入

6、每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？　　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中扣除背景信号。因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的

7、纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封