分子生物学与细胞生物学实验基本技术

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1、分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为

2、例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒置相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5

3、cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1NHCl1.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次

4、。4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。5.贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。6.培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。7.换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。组织块培养法也

5、可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。注意事项1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3.组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄

6、层血清、胎汁或鼠尾胶等。4.原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验二消化培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养二、概述此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要

7、根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、材料：（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱1.摇床（37℃）2.冰箱（4℃、-20℃）3.倒置相差显微镜4.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头、直头）3.烧杯（200ml、10ml）4.玻璃瓶（250ml、100ml）5.玻璃漏斗6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.15ml离心管5.EP管（四）其他物品1.

8、微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩）5.红血球计数板6.泡沫板7.大头针8.尼龙网膜（140目）（五）试剂1.D-Hanks液利益2.小牛血清3.DMEM4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：取新生1～3天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固