基于复合纳米材料-离子液体的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制并用于有机磷农药的检测

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1、基于复合纳米材料-离子液体的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制并用于有机磷农药的检测.doc1基于复合纳米材料-离子液体的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制并用于有机磷农药的检测的综述1引言目前食品安全是全社会广泛关注的焦点问题。近几年，虽然国内外不断加大对食品安全监管的力度，但“从农田到餐桌”的食品产业链条依然危机四伏，不断通过各种媒体进入公众视野的如“瘦肉精”猪肉中毒事件、“劣质奶粉事件”、“苏丹红事件”、“多宝鱼”、“二噁英”、“农药残留”等事件，使民众对食品安全忧心忡忡。在原料农、牧产品的生产中，大量不合理的使用兽药、化肥、激素，使农业及农村环境污染日益加剧，大量有毒有害物质附着沉

2、淀在农（畜）产品中，如水果、蔬菜中的有机磷、有机氯农药的残留，在草莓、番茄、香蕉、西瓜等农产品中使用催熟剂，粮食作物中铅、镉等重金属污染，猪肉中瘦肉精、禁用兽药等的残留都会引起慢性、急性食物中毒，食品安全从原料开始，便受到严重的威胁。在水产品养殖业中，不法业主为了提高水产品的成活率和出品率，不惜使用禁用鱼药，甚至使用激素类药物，有些药物代谢速度非常慢，因此大量残留在成品中，严重威胁着人民群众的身体健康。在食品安全检测中，农药残留量已经成为重要的检测指标。农药残留检测技术和标准是保证食品安全的重要支撑。时代的发展对食品农药残留检测的灵敏度要求越来越高，检测范围也在扩大。农药残留检测不仅要

3、检测农药的目标物，还要对其毒性比较大的代谢物进行检测。这无疑对食品农药残留的检测提出了更高的要求。现在常用的检测手段有色谱法、色谱-质谱联用法和波谱法[1,2]，这些方法虽然选择性和灵敏度较好，但仪器复杂、价格昂贵、操作繁琐、使用成本高、难以在现场使用，因而普及困难。因此，迫切需要研究和开发一些快速、方便、可靠的食品安全检测技术。生物传感器分析技术与传统的检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，它作为一种检测手段已在食品安全检测领域得到广泛的研究与应用。生物传感器[3]的应用大大缩短了农药残留的检测所用的时间，而且基于电化学方法的生物传感器，为仪器的小

4、型化、智能化提供了可能。电化学生物传感器的原理如图1所示，其构成包括两部分：生物敏感膜和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表（检测放大器）放大并输出，便可知道待测物浓度[4,5]。图1：电化学生物传感器示意图电化学生物传感器根据生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、DNA传感器及组织传感器等。而基于酶的电化学生物传感器主要有电压型[6]、电流型[7]和电压电流型三类。所用的酶类主要有水解酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等，进

5、而形成了单酶型(胆碱酯酶或水解酶)和双酶型(胆碱酯酶与胆碱氧化酶)的电化学生物传感器。近年来，基于特定酶活性的抑制原理设计的酶生物传感器(EBS)在农药残留的检测方面受到极大的关注，例如乙酰胆碱酯酶生物传感器在农药残留方面的检测。乙酰胆碱酯酶(AChE，也称真胆碱酯酶)，广泛存在于动物的组织、血液、昆虫组织及植物中。早在30多年前，就有AChE提取方法的报道。由于昆虫饲养容易且繁殖周期短，因此昆虫的乙酰胆碱酯酶[8,9]的提取倍受青睐。多以昆虫幼虫为材料分离纯化乙酰胆碱酯酶。目前，主要有两种提取乙酰胆碱酯酶的方法：一种是硫酸铵和丙酮沉淀法；另一种是凝胶过滤层析法(SephadexG-1

6、00和G-200两种)。现在市场上使用的酶主要是从敏感家蝇头部提取纯化的乙酰胆碱酯酶[10,11]。胆碱酯酶电流型传感器的工作原理[12,13]：底物氯化乙酰硫代胆碱酯酶在催化作用下水解为乙酸和巯基胆碱，巯基胆碱是具有电活性的物质，在外加一定电势的前提下，可在pt、玻璃等基础电极表面氧化，产生的氧化电流强度可反映出它的电极表面的浓度。当胆碱酯酶被农药抑制时，氧化电流的大小能准确的反映出酶被抑制的程度，从而检测出农药残留的浓度。CH3-CO-O(CH3)2-NCl(CH3)3→CH3-COOH+HO-(CH2)2-NCl(CH3)3(1)Enz-Ser-OH+R-O-PO-(OCH3)2

7、→Enz-Ser-O-PO-(OCH3)2+R-OH(2)水解检测氯化硫代乙酰胆碱水解电流并按下式计算AChE的百分抑制率：A=[(I0-I)/I0]×100％A：酶的百分抑制率（与农药残留具有正相关性）I0：未被有机磷抑制的酶电极稳定响应电流（空白电流）I：指被有机磷抑制后酶电极的稳态响应电流2国内外研究进展2.1乙酰胆碱酯酶的固定化2.1.1吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表