结核病实验室诊断技术新进展

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1、结核病实验室诊断技术新进展山东省结核病防治中心王海英2011.11.5主要内容结核病实验室常用的诊断技术和方法结核病实验室新的诊断技术和方法未来实验室结核病的诊断模式21、细菌学方法2、免疫学方法3、分子生物学方法33一、目前实验室常用检测方法1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）44一、目前实验室常用检测方法培养onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony显

2、微镜检查脱色复染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain2、免疫学方法抗体检测是结核病辅助诊断手段，对菌阴肺结核有一定的参考价值。1、酶联免疫吸附试验2、免疫胶体金标技术55一、目前实验室常用检测方法67潜伏结核感染者的筛查结核菌素PPD试验3、分子生物学方法实时荧光定量PCR技术：也称分子信标技术，是今年发展起来的核酸定量技术。是PCR与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的高特异性相结合。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一

3、寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。88一、目前实验室常用检测方法99二、新诊断技术和方法分类新方法用途细菌学检查LED(发光二极管显微镜)涂片检查免疫学方法-干扰素释放实验潜伏感染者分子生物学LAMP(等温扩增)涂阴

4、涂阳LPA(线性探针)MDR-TB,鉴定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鉴定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂阴分子分型技术指纹图谱分析其他DNA测序法突变检测HPLC胞壁成分检测1010二、新诊断技术和方法1、细菌学检查发光二极管（LED）荧光显微镜光源寿命长（30,000h）不需要预热不需要暗室可用现有的显微镜可使用电池电源与通常荧光显微镜的判定一致率98.0%两种方法观察结果Z-N染色镜检结果LED镜检结果二、新诊断技术和方法中盖项目LED评估结果初诊患者LED涂阳患者检出

5、率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46%(460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000）随访患者LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000）中盖项目LED评估结果读片时间LED读片时间120.03±38.88秒，明场显微镜206.31±75.86秒（p=0.00）使用接受度调查对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量

6、大的实验室优先使用1414二、新诊断技术和方法单核细胞分离TB抗原刺激，IFN-释放与标记的二抗结合酶作用标记物－显色每一斑点代表释放IFN-的一个细胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原一抗捕获IFN-2、免疫学方法：-干扰素释放实验BCG进化过程1616二、新诊断技术和方法分子生物学LAMP(等温扩增)LPA(线性探针)Genechip(基因芯片)GeneXpert(多色巢式定量PCR)分子分型技术1717二、新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loopmedia

7、tedisothermalamplification，LAMP)：Eiken,Japan•可同时检测患者是否感染结核所用仪器设备极其简单63℃扩增（避免非特异性扩增多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性•密闭系统(没有污染的风险）•快速，两小时内即可得到检测结果，•肉眼观察1818二、新诊断技术和方法（1）环介导等温扩增技术(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)临床标本（咯痰等）DNA提取基因扩增

8、基因检出标本处理Extractionsolution1and210min,100℃1min,2000gSupernatant，captureDNAReconstitutereactionmix40min,67℃LAMPamplification＋－PCRLAMP・需要使用PCR扩增仪・设计特异性的两条引物・扩增效率:107・不需要使用PCR扩增仪・多对引物保证扩增的特异性・扩增效率:1010二、新诊断技术和方法（