血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

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1、实验二血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1.了解电泳的基本原理；2.掌握电泳分离蛋白质的原理；3.掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。二、实验原理1.电泳的基本原理电泳——是带电质点在电场力作用下发生定向移动的现象。电泳技术——是利用电泳现象进行物质分离、纯化及鉴定的技术。电泳速度的方向：电泳速度的大小：V=QE6πR∝QR–正极负极F´FF=F´电场力F=QE摩擦力F´=6πRVQE=6πRV运动速度2.电泳分离蛋白质的原理蛋白质的两性电离和等电点：等电点——即pI(isoelectricpoint)，当氨基酸酸碱电离的速

2、度相等时，即当蛋白质所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH就是此蛋白质的等电点PI。COOHNH3+ProCOO–NH3+ProCOO–NH2PropHpHpI碱性电离酸性电离当pH=PI时，所带电荷为0，粒子是静止的；当pH>PI时，酸性电离，释放氢离子，带负电，运动方向是从负极向正极移动；当pH

3、动。由于各种血清蛋白的等电点不同，在同一pH下带的电荷数也不同，加上各蛋白质的分子大小也有差别，因此在电场中的移动速度不同。带电荷多、相对分子量小的蛋白质泳动较快，带电荷少、相对分子量大的泳动较慢。这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同，从而可将血清蛋白分离成数条区带。3.醋纤膜分离血清蛋白质的原理醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应

4、用范围广，快速简便,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析，因此目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋纤膜分离血清蛋白质的方法以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后再经染色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的区带，从正极依次为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。染料与蛋白质的结合是与蛋白质的量成正比，可将各条带分别溶于碱性溶液再进行比色测定，或用一定的有机溶剂是薄膜透明化后直

5、接用光密度扫描，从而计算出血清蛋白质的含量。三、主要试剂与器材：试剂：血清巴比妥缓冲液染色液，漂洗液器材：电泳仪，电泳槽醋酸纤维素薄膜（2×8cm）血清加样器四、操作步骤：1.浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中，充分浸透后用镊子取出（约20min，直到膜上没有斑点，中间没有气泡为止）。2.点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约1.5cm处，与边缘平行直线状点加3~5μL待分离血清。注意取样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。1.5cm3.搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两端，其下端要浸入缓冲液

6、中。然后，将点好样的薄膜光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向，点样的一端位于负极，点样线不能搭在滤纸上。醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图4.电泳：红正黑负。电流2mA/膜。电泳时间约50min。5.染色：氨基黑10B,染色2～3min.6.脱色：在装有漂洗液的2个漂洗缸中，依次漂去多余染料，直到背景漂白为止。五、结果与分析：1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法六、临床意义根据电泳图谱，分析每条色带的前后位置、染色深浅及区带宽窄等，可以判定血清蛋白质有无种类及含量的变化，进而

7、帮助诊断疾病。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。1、M蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在β-球蛋白区、γ-球蛋白区或两者之间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰的M蛋白带。2、蛋白质缺乏症3、肾病4、急慢性炎症5、肝病：肝硬化出现“β-γ桥”原发性肝癌在Alb与α1-球蛋白之间出现一小的区带，称为甲胎蛋白带几种疾病的蛋白电泳变化七、注意事项：1.点样时,毛面向上,要求样线粗细均匀，无明显扩散现象。2.搭桥时,光面向上,点样端置于负极,样线不能接触滤纸

8、。3.正确连接导线(红色—正极，黑色—负极）。4.电泳过程中，严禁再取放薄膜。