流式细胞技术（张华屏）ppt培训课件

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1、流式细胞术FLOWCYTOMETRY张华屏主要内容流式细胞术的概念流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的结果显示方式FCM在生物医学方面的应用流式细胞仪（FlowCytometer,FCM）是一项集激光技术、流体力学技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。特点（5）高纯度分选技术（1）测量速度快（2）高灵敏度（3）高精确度（4）多参数（多参数流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算

2、机和分析系统。待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交，细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。散射信号在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0℃角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90℃角散射。这里所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴

3、向方向之间大致所成的角度。散射光信号—前向散射光FSC----Forward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FSC的强度与细胞或其他颗粒的大小有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小前向角散射光散射光信号–侧向角散射光SSC-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SSC的强度与细胞或其他颗粒的形状及结构的均匀度（opticalhomogeneity）有关SSC用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比侧向散射光荧光信号荧光信号主要包括两部

4、分①自发荧光，不经荧光染色，细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光。②特征荧光，由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号荧光素种类FITC(异硫氰酸荧光素

5、）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm488nm波长的氩离子激光激发APC(别藻兰蛋白）：红色660nm630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发流式细胞仪的荧光信号数据显示方式单参数直方图双参数二维点图等高图二维密度图三维图单参数直方图（Histogram）X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率双参数二维点图二维等高图和密度图Pseudo3DPlot3DPlot

6、FCM的数据分析：相应的分析软件，如CellQuest和ModFit等流式细胞仪可测量的主要参数细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体流式细胞仪的临床应用白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤细胞的周期和倍体分析网织红细胞和网织血小板计数移植前的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数血小板功能及相关疾病细胞生物学是FCM应用最广泛也是最基本的领域，细胞周期分析是其基本分析内容之一，而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的DNA含量来达到的。流式细胞术

7、的应用举例众所周知，细胞周期由G1期、S期、G2期和M期所构成的。各期细胞的DNA含量如下：G1期为2C，G2期和M期为4C，S期则在2C到4C之间。所以在FCM的DNA直方图上形成的谱线则为峰分布，而且G1峰的道数恰好是G2和M峰道数的一半。研究表明：对于正常细胞群，各周期时相的细胞数的比例是同一的；对于恶性病变的细胞群则是非均一的。G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEventsAtypicalDNAHistogramofcellproliferation2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体AnnexinV