细胞离心方法和原理

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1、离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）　　用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

2、分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。密度梯度离心原理　　不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。密度梯度离心法densitygradientcentrifugationmethod　　〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产

3、生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用

4、密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。差速离心法是根据颗粒大小和密

5、度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。密度梯度离心法是在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法。各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。密度梯度可以离心前预先制备或在离心中自然形成。可用于分析型或制备型的离心分离。1:密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的;差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分

6、级分离。2:密度梯度离心只用一个离心转速，而差速离心用两个甚至更多的转速。3：密度梯度离心的物质是密度有一定差异的，而差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分。二者都是依靠离心力对细胞匀浆悬浮扔中的颗粒进行分离的技术。差速离心是一种较为简便的分离法，常用于细胞核和细胞器的分离。因为在密度均一的介质中，颗粒越大沉降越快，反之则沉降较慢。这种离心方法只能将那些大小有显著差异的组分分开，而且所获得的分离组分往往不很纯；而密度梯度离心则是较为精细的分离手段，这种方法的关键是先在离心管中制备出蔗糖或氯化铯等介质的浓度梯度并将细胞匀浆装在最上

7、层，密度梯度的介质可以稳定沉淀成分，防止对流混合，在此条件下离心，细胞不同组分将以不同速率沉降并形成不同沉降带。沉降系数（sedimentationcoefficient）　　用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降速度表示，（thevelocityperunitforce）并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒.沉降系数越大在离心时候越先

8、沉降。如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。定义　　沉降系数（sedime