原代心肌细胞培养方法探讨

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1、原代心肌细胞培养方法探讨山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培

2、养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠ExploreamethodofneonatalratmyocardialcellsincultureZHOUSuning,SHAOJianhua.MedicalcollegeofShandonguniversity,thepeople’shospitalofShandongprovince,Jinan250021,ChinaAbstractToexploreareliablemethodofneonatalratmyocardialcellsinculture.T

3、heplotsofmyocardialtissuefromneonatalWisterratwereculturedandpurifiedwiththemethodofdifferentialenzymeand5-Bromodeoxyuridine-treatment.Microscope,transmissionelectronmicroscope,HEstains,Trypanbluestains,immunohistochemicaltestweredeterminedtoidentificationthecell.There

4、sultsofmyocardialcellsgrowrapidity,automaticity,shapeintact,thecelloffilamentandmitochondriaclearly.Thecellviabilitywasupto94.6%byTrypanbluestains.Thecellpuritywasupto96.4%byActin（HHF35）ofStreptavidinperoxidaseconjunctionmethod.Thismethodofmyocardialcellsinculturewasgr

5、ownuprapidity,livelywell,highpurity.KeywordsMyocardialCells;Culture;Rat随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。1材料与方法1.1心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取

6、组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM43ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放

7、置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰蛋白酶液加入含有0.1mmol/LBrdu培养液5～10ml在标记处反复吹打，计数板计数细胞5×105/ml，根据需要传至培养瓶（板）中培养，多数3～4天后长成致密单层可用于实验。1.2培养心肌细胞的鉴定1.2.1心肌细胞形态观察常规倒置显微镜观察细胞形态变化、心肌细胞搏动情况，并随时用LeicaDMIRBMicrosystems记录（Leica,德国）；取培养心肌细胞单层飞片行苏木素－伊红染色（HE染色）后，光学显微镜下观察并照片。培养细胞用0.1％胰蛋白酶

8、消化后，离心，沉淀固定，送电镜室制片，透射电镜观察并摄片。1.2.2细胞成活率的测定取细胞悬液，并作适当稀释106/ml，按9:1加入0.4％台盼篮溶液混匀，显微镜下用计数器计数活细胞和死细胞。1.2.3鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（HH