western blotting操作指南

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1、WesternBlot操作指导一：蛋白提取1、组织蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5mlEP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。2）操作步骤：a.制冰机制冰；b.标记笔将两套EP管做好标记；c.

2、将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1mlPBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1mlPBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三

3、去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF（二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT=1:0.8:0.2加入2×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免

4、管盖爆开）；i.将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。2、贴壁细胞蛋白提取（细胞蛋白含量一般约为1x10-9mg/细胞）1）所需器材：制冰机、细胞刮刀、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、两个大冰盒、手套、长满细胞的培养瓶、保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、滤纸、离心机、烧杯、4×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步骤a.制冰机制冰；b.细胞刮

5、刀用去离子水洗净、甩干，标记笔将2套EP管做好标记；c.将两个大冰盒装上冰，标记笔做好标记的两套EP管置于一个大冰盒上,带上另一个大冰盒，取出长满细胞的培养瓶平放在大冰盒上；d.戴好手套，取出保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF置于放有EP管的大冰盒上，往培养瓶中滴加2mlPBS漂洗一次，滤纸尽可能吸干瓶口残留液体；e.往培养瓶中滴加三去污裂解液（一般为47－141ul/50ml培养瓶）、再加入PMSF（二者比例为94：6），然后用细胞刮棒刮（不要漏刮四周瓶壁，刮不同处理组要更换刮子或重新洗净，滤纸擦干），倾角静置（使培养瓶内细胞裂解

6、液集于一角），移液枪将培养瓶的裂解液吸至1.5mlEP管，冰上静置15-25分钟，以上步骤均需在冰上操作；f.离心机预冷，将静置15-25分钟后的EP管4℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好4×SDS凝胶上样缓冲液（存放在常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液枪将离心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i.

7、将泡沫板用镊子夹出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。3、悬浮细胞蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、两个大冰盒、长满细胞的培养瓶、10ml离心管、手套、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、滤纸、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、4×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步骤a.制冰机制冰；b.标记笔将2套EP管做好标记；c.将两个大冰

8、盒装上冰，