多聚酶链式反应扩增dna片断

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1、专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖学习目标1、体验PCR这一分子生物学实验方法2、理解PCR原理3、了解PCR应用多聚酶链式反应(PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。一、基础知识PCR技术扩增时，DNA的复制过程和细胞中的类似脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤

2、（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）㈠.DNA分子的结构1.元素组成：C、H、O、N、P2.基本单位:脱氧核苷酸一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.脱氧核苷酸链的形成多脱氧核苷酸链结构简图4、DNA分子的平面结构AT

3、GCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端识别：DNA分子的3′端与5′端-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。5.DNA分子的双螺旋结构⑴.DNA分子是由的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。⑵.与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。⑶.两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与配对，一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸

4、DNA聚合酶引物打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸㈡.DNA的复制思考：体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA如何提供相似环境？㈢.PCR(多聚酶链式反应）2.DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。3.DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。1.定

5、义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’4、PCR原理⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但

6、是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。(4.）TaqDNA聚合酶的应用PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。（5）.PCR技术的特点：⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸（6).细胞内复制和PCR不同点⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的(7).PCR

7、的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。二、PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列

8、配对结合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序