骨髓细胞染色体标本的制备

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1、实验室名称项目编号制定日期遗传室骨髓细胞染色体标本的制备********年**月**日【目的】保证骨髓细胞染色体的成功制备。【适用范围】用于白血病的染色体检查。【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。【步骤】一.骨髓细胞直接法1采集标本：用0.2％肝素浸润针筒，抽取0.2－1ml骨髓（视增生程度而异），注入Hank’s液20ml瓶内；2加入有丝分裂阻断剂：立即加入长春花碱应用液0.05ml-0.1ml(1-2滴)，终浓度0.025－0.05ug

2、/ml,或秋水仙胺（素）100ul,终浓度0.05ug/ml,置37℃温箱1小时；3收获细胞：将含骨髓细胞的Hank’s液倒入离心管内，离心1000rpm×10分钟；4低渗：弃上清液，向管底细胞团加入已预温至37℃的0.075MKcl6-8ml/管，轻轻打匀，置37℃温箱40分钟。5预固定：加入1ml/管新鲜配置固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），打匀，立即离心1000rmp×10分钟；6第一次固定：弃上清液，向管底细胞团加入固定液约8ml/管，打匀后置室温内静置30分钟；7按上法在重复固定两次，每次15分钟；8三次固定后，离

3、心1000rmp×10分钟，弃上清液，加入适量固定液，配成浓度合适的细胞悬液；9制片：气干法加火焰烘烤；10染色：10％Giemsa染20分钟左右，水洗、镜检、以观察分裂相数量和质量。制得的细胞悬液可置4℃冰箱保存数周到数月，随时可供各种显带处理。我们目前采用生理盐水10ml代替Hank’s液，结果相同，而费用则更为节省。二.骨髓细胞短期培养法1无菌下抽取骨髓1－3ml后注入5ml1640培养基内，带回实验室后在超净台中抽取20ul骨髓细胞培养液，加入0.38ml白细胞稀释液中，进行有核细胞计数，按1－2×106/ml的细

4、胞终浓度接种于1640培养基内，至于2份，置37℃温箱24－48小时。以下步骤同直接法。三.骨髓细胞同步化培养1细胞按1－2×106/ml终浓度在1640培养基内预培养24小时后，加入FdU(终浓度3×10-7M)和Ud(终浓度2ug/ml)37℃温箱内置17小时；2在加入BrdU(终浓度30ug/ml)37℃温箱小时，之后加入秋水仙胺（终浓度0.05ug/ml）37℃15分钟以下各步骤与直接法相同。当骨髓细胞染色体分析发现100％的细胞均为异常核型时，则有必要进一步加做外周血＋PHA的培养，以除外体质性染色体异常。直接法

5、培养法同步法PB+PHA优点简单、方便异常检出率高异常检出率高,且带纹精细，有助于确定断裂点、识别微小畸变和进行基因定位除外体质性畸变缺点质量稍差，异常检出率低培养结果受温度。培养液PH，小牛血清效价等多种因素影响费时多、成本高、手续烦、不适合常规使用对检出白血病核型异常无帮助适应症CGL、ALL、MDSANLL、MDS、CGL-BcANLL、MDS、CGL-Bc骨髓细胞异常核型为100％时操作人员部门主管质量负责人姓名吴芬************日期04年07月23日